تقنية كريسبر (CRISPR) هي تقنية لتحرير الجينوم من الجيل الثالث: لقد أحدثت تقنية كريسبر ثورة في العالم

تقنية كريسبر (CRISPR) هي تقنية لتحرير الجينوم من الجيل الثالث، أحدثت ثورة في العالم بفضل نتائجها عالية الإنتاجية. وقد استُخدمت لعلاج العديد من الأمراض والعدوى البيولوجية. كما تمتلك أنواع مختلفة من البكتيريا والكائنات بدائية النواة الأخرى (مثل العتائق) أنظمة كريسبر/كاس9 للدفاع ضد العاثيات. وقد أُفيد بأن الاستراتيجيات القائمة على كريسبر/كاس9 قادرة على تثبيط نمو وتطور سرطان الثدي ثلاثي السلبية (TNBC) من خلال استهداف جينات المقاومة المُحتملة، وعمليات النسخ، والتنظيم فوق الجيني. قد تُساعد هذه التدخلات العلاجية في معالجة مشاكل مُعقدة مثل مقاومة الأدوية التي تُلاحظ حتى في سرطان الثدي ثلاثي السلبية. حاليًا، تُستخدم طرق مُتعددة لإيصال كريسبر/كاس9 إلى الخلايا المُستهدفة، مثل الطرق الفيزيائية (الحقن المجهري، والتحفيز الكهربائي، والطرق الهيدروديناميكية)، والفيروسية (الفيروسات الغدية المرتبطة والفيروسات البطيئة)، وغير الفيروسية (الجسيمات الشحمية والجسيمات النانوية الدهنية). على الرغم من تطوير نماذج متنوعة لدراسة الأسباب الجزيئية لسرطان الثدي الثلاثي السلبي، إلا أن نقص الطرق الحساسة والموجهة لإيصال أدوات تعديل الجينوم داخل الجسم الحي يحد من تطبيقها السريري. باختصار، تستعرض هذه المراجعة بشكل شامل التقدم المحرز والتحديات والقيود والآفاق المستقبلية لعلاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي بتقنية كريسبر/كاس9، استنادًا إلى الأدلة المتوفرة. كما نسلط الضوء على كيفية تحسين استراتيجيات كريسبر/كاس9 في علاج هذا النوع من السرطان من خلال دمج الذكاء الاصطناعي والتعلم الآلي.
يتميز السرطان بانقسام الخلايا غير المنضبط، واضطراب نقاط التفتيش في دورة الخلية، وطفرات في جينات كابتة الأورام (ماثيوز وآخرون، 2022). ومن بين أنواع السرطان المختلفة، يُعد سرطان الثدي أكثر أنواع السرطان شيوعًا بين النساء، وله معدل وفيات مرتفع عالميًا (واكس ووينر، 2019). سرطان الثدي مرض غير متجانس ذو خصائص متنوعة، مثل السمات النسيجية والبيولوجية، والعرض السريري والسلوك، والاستجابة للعلاج (ويغلت وآخرون، 2010). يوفر تصنيف سرطان الثدي رؤى دقيقة لتشخيص سرطان الثدي والتنبؤ بمآل الورم. وقد كان استخدام المؤشرات الحيوية الشائعة والسمات السريرية المرضية المعيار الرئيسي لتصنيف سرطان الثدي (تسانغ وتسي، 2019). يتأثر تشخيص سرطان الثدي والاستجابة للعلاج بعوامل عديدة، منها وجود مستقبلات الإستروجين (ER)، ومستقبلات البروجسترون (PR)، ومستقبل عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2/neu)، والدرجة النسيجية، ونوع الورم، وحجمه، وانتشاره إلى العقد اللمفاوية (الطبائي، 2020). وقد تم تحديد خمسة أنماط جزيئية فرعية لسرطان الثدي، تشمل النمط اللمعي A، والنمط اللمعي B، والنمط الغني بـ HER2، والنمط القاعدي، والنمط منخفض الكلاودين (برات وآخرون، 2015). يُعد سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) نمطًا جزيئيًا فرعيًا لا يُظهر جميع مستقبلات الإستروجين والبروجسترون وHER2 (ين وآخرون، 2020). وترتبط هذه الخصائص المرضية بسرطان الثدي الثلاثي السلبي، مما يؤكد سرعة تطوره وطبيعته الأكثر شراسة من أي نوع آخر من سرطان الثدي (فينغ وآخرون، 2018). بالإضافة إلى ذلك، استخدم بيرو وآخرون (2000) تقنية المصفوفات الدقيقة لإعادة تصنيف سرطان الثدي وتحديد خمسة أنواع فرعية جوهرية منه (كاديناس، 2012). يُعد سرطان الثدي الشبيه بالخلايا القاعدية نوعًا فرعيًا من سرطان الثدي يتميز بنمط ظاهري ثلاثي السلبية، ويرتبط بتطور سريع. تجدر الإشارة إلى أن جميع حالات سرطان الثدي الشبيه بالخلايا القاعدية تُشخص خطأً في كثير من الأحيان على أنها سرطان ثدي ثلاثي السلبية، مع أن 77% منها فقط هي كذلك. في المقابل، تتراوح نسبة حالات سرطان الثدي ثلاثي السلبية الشبيهة بالخلايا القاعدية بين 71% و91%، مما يشير إلى تداخل هذين النوعين من سرطان الثدي واختلاف تصنيفاتهما (وانغ وآخرون، 2019). هذا الأمر يستدعي توصيف عدم تجانس سرطان الثدي ثلاثي السلبية لتوضيح التنبؤات وتحديد الاستجابات المحتملة للعلاجات الحالية والمستقبلية. علاوة على ذلك، يُمثل سرطان الثدي ثلاثي السلبية ما بين 15% و20% من جميع حالات سرطان الثدي، وهو أكثر شيوعًا بين النساء دون سن الخمسين. تم الإبلاغ عن طفرات في جيني BRCA1 أو BRCA2 في حوالي 20% من حالات سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). كما أظهرت الدراسات أن سرطان الثدي الثلاثي السلبي يتميز ببيئة مناعية دقيقة فريدة، تشمل مستويات عالية من عوامل نمو بطانة الأوعية الدموية، والبلعميات المرتبطة بالورم، والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم، وجزيئات أخرى تُشارك في نمو الورم وانتشاره. لذا، يُعد فهم البيئة الدقيقة لسرطان الثدي الثلاثي السلبي أمرًا بالغ الأهمية لتشخيصه وعلاجه (Fan and He, 2022).
لتقييم مآل سرطان الثدي الثلاثي السلبي وضمان فعالية العلاج، يُعد التشخيص الدقيق، الذي يعتمد بشكل أساسي على الكيمياء النسيجية المناعية للكشف عن مستقبلات هرمون الإستروجين والبروجسترون ومستقبلات عامل نمو البشرة 2، والتصوير الشعاعي للثدي للكشف عن أورام الثدي، أمرًا بالغ الأهمية. مع ذلك، لا يُمكن للتصوير الشعاعي للثدي إظهار خصائص الورم الداخلية بشكل كافٍ، مثل النخر والتليف (ديباك سينغ وآخرون، 2021). ونظرًا لأن سوء المآل والتشخيص يحولان دون وصف الأطباء للأدوية المناسبة (تشودري، 2020)، تُستخدم استراتيجيات متنوعة لتحسين رعاية المرضى المصابين بسرطان الثدي الثلاثي السلبي. حاليًا، يُستخدم دواءان، دوكسوروبيسين وسيكلوفوسفاميد، لعلاج المرضى المصابين بهذا النوع من السرطان، وقد أظهرا نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم أدوية أخرى من البلاتين، مثل كاربوبلاتين وسيسبلاتين (سيكوف وآخرون، 2015). بالإضافة إلى ذلك، استُخدمت مثبطات PARP مثل أولاباريب وفيلاباريب وPF-01367338 كأدوية علاج كيميائي محتملة لعلاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي (إيشينو وآخرون، 2018). ونظرًا لأن مسارات إشارات Wnt/β-Catenin وNOTCH وHedgehog قد ثبت تورطها في حدوث سرطان الثدي الثلاثي السلبي وتطوره، فإن استهداف هذه المسارات بالأدوية قد يكون استراتيجية مهمة (أيسولا وآخرون، 2013). وعلى الرغم من أن الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي لا تزال هي الركائز الأساسية لعلاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي اليوم، فقد أُحرز تقدم كبير في تطوير علاجات جديدة تشمل العلاج الموجه، والعلاج المناعي، وأدوات تحرير الجينات المختلفة المرتبطة بتقنية CRISPR مثل Cas9n وdCas9 وCRISPR/Cas12 والتحرير الأولي والعلاج الجيني الموجه بتقنية CRISPR/Cas9. وسنركز هنا على أدوات تحرير الجينات المختلفة المرتبطة بتقنية CRISPR المستخدمة في علاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي. ومن بينها، حظيت تقنية CRISPR/Cas9 باهتمام واسع النطاق.
Cas9n، المعروف أيضًا باسم Cas9 nickase، هو نسخة معدلة وراثيًا من بروتين Cas9، مُشتقة من نظام تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). يحتوي بروتين Cas9 في شكله الأصلي على نطاقين نوكليازيين: RuvC وHNH، ووظيفتهما الرئيسية هي قطع كلا سلسلتي الحمض النووي. مع ذلك، في Cas9n، طُفر أحد النطاقين النوكليازيين، وهو HNH، وراثيًا وأصبح غير نشط. لذلك، يبقى نطاق HNH في Cas9n غير فعال. ويبقى نطاق RuvC فقط نشطًا، مما يسمح لـ Cas9n بقطع أو إحداث فواصل في سلسلة واحدة من الحمض النووي (Trevino and Zhang, 2014). بالمقارنة مع Cas9، يُمكن لـ Cas9n تقليل التأثيرات الجانبية بفعالية وتحسين آليات إصلاح الخلايا بدقة. يُمكن استخدام Cas9n لحل مشاكل متنوعة، مثل إحداث فواصل في مواقع محددة في الحمض النووي المزدوج. لهذا الغرض، تم دمج جزيئين من Cas9n واستخدامهما معًا (Yee، 2016). يُعدّ كيناز السلالة المختلطة 3 (MLK3) كيناز بروتين مُنشّط بالميتوجين، ويعمل كمنظم رئيسي أثناء انتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Cronan et al.، 2012).
يُمكن لبروتين MLK3 تنشيط مسارات إشارات متعددة تؤدي إلى انتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي. فعلى سبيل المثال، يُنظم مسار كيناز c-Jun الطرفي N (JNK) حركة الخلايا وتحلل المادة الخلوية خارج الخلية، ويُنشط MLK3 مسار JNK، مما يُعزز حركة الخلايا ويُكسبها خصائص غازية (راتاناسينشاي وغالو، 2016). كما يُنظم MLK3 عملية التحول الظهاري-الميزانشيمي (EMT). وللقيام بذلك، يُنشط عوامل النسخ اللاحقة مثل Snail وSlug وTwist. تُثبط هذه العوامل التعبير عن المؤشرات الظهارية وتُعزز التعبير عن المؤشرات الميزانشيمية، مما يؤدي إلى اكتساب نمط ظاهري ورمي (كاسالينو وآخرون، 2023). وقد لوحظ أن MLK3 يلعب دورًا في إعادة تشكيل المادة الخلوية خارج الخلية وتنشيط البروتيازات مثل ميتالوبروتينيزات المصفوفة (MMPs) التي تُحلل المادة الخلوية خارج الخلية. يُسهّل هذا غزو الخلايا السرطانية وانتشارها إلى مواقع بعيدة (كاتاري وآخرون، 2019). ولذلك، أظهرت دراسات سابقة أن MLK3 يلعب دورًا حاسمًا في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. استخدم راتاناسينشاي وغالو نماذج سرطان الثدي الثلاثي السلبي لدراسة دور MLK3، ووجدا أنه يُعزز تطور السرطان من خلال مسارات إشارات محددة. استخدما تقنية CRISPR/Cas9n لتعديل MLK3، ولاحظا انخفاضًا ملحوظًا في انتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي (راتاناسينشاي وغالو، 2016).
يُعدّ dCas9، الذي يُطلق عليه غالبًا اسم Cas9 غير النشط، شكلاً مشتقًا مُعدَّلاً من بروتين Cas9. على عكس Cas9 النشط، يفتقر dCas9 إلى نشاط الإندونوكلياز، مما يجعله غير قادر على إحداث كسور في سلسلتي الحمض النووي. لذلك، يُمكن استخدام dCas9 لاستهداف مناطق مُحدَّدة من الجينوم بدقة دون أي تغييرات أو تعديلات على تسلسل الحمض النووي (وانغ وآخرون، 2016). في dCas9، يتم تعطيل بروتينين من الإندونوكلياز، هما RuvC وHNH، عن طريق تثبيط بقايا الأحماض الأمينية المهمة (ريشتر وآخرون، 2016). على الرغم من افتقاره إلى نشاط قطع الحمض النووي، يلعب dCas9 عددًا من الأدوار المهمة في البحوث الجينية والتكنولوجيا الحيوية. على سبيل المثال، يسمح بتصوير مناطق مُحدَّدة من الجينوم، ويُسهِّل تنظيم النسخ، ويُعزِّز التعديلات فوق الجينية (بروكن وآخرون، 2018).
يلعب عامل النسخ ZEB1 (بروتين ربط صندوق E ذو الأصابع الزنكية 1) دورًا محددًا وحاسمًا في عملية التحول الظهاري-اللحمي (EMT)، وهي عملية خلوية تحدث أثناء التطور الجنيني، وإصلاح الأنسجة، وتطور السرطان. وتشمل هذه العملية تحول الخلايا الظهارية إلى خلايا لحمية، مما يؤدي إلى تغييرات في شكل الخلية، وحركتها، وقدرتها على الغزو، وغيرها (Wu et al., 2020). يثبط ZEB1 العديد من المؤشرات الظهارية، مثل الإي-كاديرين والأوكلودين، المسؤولة عن الحفاظ على التصاق الخلايا الظهارية واستقطابها في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Moreno-Bueno et al., 2008). بالإضافة إلى ذلك، يُفعّل ZEB1 بعض المؤشرات الحيوية مثل N-cadherin وvimentin وfibronectin (Konradi et al., 2014)، كما يُنظّم الجينات المشاركة في إعادة تشكيل الهيكل الخلوي، مثل Rho GTPases وMMPs (Huang et al., 2014). كما يؤثر أيضًا على مسارات إشارات متنوعة، مثل عامل النمو المحول بيتا (TGF-β) وإشارات Wnt، مما يُعزز غزو الورم وانتشاره في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) (Chen et al., 2016). تشير العديد من الدراسات والأدلة العلمية إلى أن ZEB1 يمتلك إمكانات كبيرة كعامل قيّم للكشف عن سرطان الثدي الثلاثي السلبي والتدخل العلاجي فيه. في دراسة حديثة، استخدم Waryah et al. نموذجًا لسرطان الثدي الثلاثي السلبي، وحققوا كبحًا كاملًا لـ ZEB1 باستخدام dCas9. وهكذا، لاحظوا خصوصية عالية للغاية وتثبيطًا شبه كامل لـ ZEB1 في الظروف الحية (Waryah et al.، 2023).
تُعدّ تقنية CRISPR/Cas12 أداةً لتعديل الجينات تُعرف باسم CRISPR/Cpf1. وهي مشتقة من نظام CRISPR/Cas، حيث يشير مصطلح Cas12 إلى البروتين المرتبط بـ CRISPR رقم 12 (Bharathkumar et al., 2022)، وهو مشابه تمامًا لـ Cas9. والفرق الوحيد هو احتوائها على بروتين Cas12. بالمقارنة مع Cas9، يتميز Cas12 بوظائف فريدة، مثل توليد نهايات لاصقة أثناء عملية تعديل الجينات، بينما يُولّد Cas9 نهايات غير لاصقة (Wang et al., 2021). تُسهم هذه الخاصية لـ Cas12 في تقنيته المتخصصة في معالجة الحمض النووي. وباعتباره بروتينًا قادرًا على التعرّف بدقة على الحمض النووي المستهدف وقطعه، فإنه يتمتع بتعدد استخدامات استثنائي، مما يجعله أداة فعّالة لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك تعديل الجينات (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
على غرار متغيرات CRISPR الأخرى، يُمكن لتقنية CRISPR/Cas12 تعطيل أو تنشيط الجينات في سرطان الثدي الثلاثي السلبي، مستهدفةً الجينات التي تلعب دورًا هامًا في نشأته أو استجابته للعلاج (يانغ وتشانغ، 2023). ولتحقيق هذه العملية، طُوِّرَ حمض نووي ريبوزي مرشد (gRNA) يُوجِّه Cas12 إلى الجين المستهدف. بمجرد ارتباط Cas12 بهدفه، يُحدث كسورًا في سلسلتي الحمض النووي ويُنشِّط آليات إصلاح الحمض النووي. خلال عملية الإصلاح، قد تُدخَل نيوكليوتيدات غير صحيحة، مما يؤدي إلى طفرات جينية وفقدان وظيفتها (تشانغ وآخرون، 2021أ). إضافةً إلى ذلك، استُخدمت نسخة مُحسَّنة من إنزيم Cas12 (تُسمى dCas12) لتنشيط الجينات. ومن خلال دمجها مع مُنشِّط النسخ، يُمكن تحفيز جينات مُحدَّدة، وبالتالي تنشيطها. تتمتع هذه التقنية بإمكانات كبيرة في تعزيز تنشيط جينات كابتة للأورام (سلطان وآخرون، 2022).
تُعدّ تقنية التحرير الأولي تقنيةً حديثةً ومتطورةً للغاية لتحرير الجينوم، إذ تُتيح تعديل الحمض النووي للكائن الحي بدقةٍ متناهية (Chen and Liu, 2023). وتتحقق هذه التقنية من خلال دمج مُكوّنين رئيسيين: إنزيم CRISPR/Cas9 المُعدّل وإنزيم النسخ العكسي. يتمثل دور إنزيم CRISPR/Cas9 في استهداف مواقع مُحددة بدقة في الجينوم، بينما يُساعد إنزيم النسخ العكسي في تعديل الحمض النووي بشكلٍ كامل في الموقع المُستهدف (Hassan et al., 2021). في آلية التحرير الأولي، تتضمن الخطوة الأولى إنشاء دليل الحمض النووي الريبوزي (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). يحتوي هذا الدليل على التسلسل المُستهدف وقالب الحمض النووي الريبوزي المُطابق لموقع التحرير المطلوب في الحمض النووي المُستهدف. بعد ذلك، يُدخل دليل الحمض النووي الريبوزي (pegRNA) إلى الخلايا المُستهدفة مع إنزيم نوكلياز التحرير الأولي (PE2). يُعدّ PE2 بروتينًا اندماجيًا يتألف من إنزيم Cas9، وإنزيم النسخ العكسي، ومُهايئ تحرير البادئات (مارتن-ألونسو وآخرون، 2021). داخل الخلية، تبحث مُركّبات pegRNA وPE2 عن الحمض النووي المُحدد الذي ترغب في تعديله. يقوم إنزيم Cas9 بقطع الحمض النووي وإنشاء قالب مُكوّن من خيوط مفردة (تشوي وآخرون، 2022). يستخدم إنزيم النسخ العكسي هذا القالب لتحضير الحمض النووي للتحرير. إلى جانب نسخ الحمض النووي، تتضمن هذه العملية أيضًا تعليمات لتحرير قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA). أخيرًا، يُستخدم خيط الحمض النووي المُنشأ حديثًا كقالب لإصلاح القطع في الحمض النووي، مما ينتج عنه تسلسل حمض نووي مُعدّل يحتوي على التعديل المطلوب (أوتشوا-سانشيز وآخرون، 2021). يُمكن أن تُؤدي آليات تحرير البادئات إلى طفرات واسعة النطاق في الجينات. يُمكنها استهداف الطفرات النقطية، والإدخالات، والحذف، وحتى استبدال الجينات (أنزالون وآخرون، 2019؛ تشين وليو، 2023). توفر تقنية التحرير الأولي العديد من المزايا مقارنة بتقنيات تحرير الجينوم السابقة. وتشمل هذه المزايا زيادة الدقة، وتقليل التأثيرات الجانبية، والقدرة على تحرير الحمض النووي دون الاعتماد على حدوث كسور في سلسلتي الحمض النووي (أنزالون وآخرون، 2020).
طُوّرت تقنية CRISPR/Cas9 في الأصل لحماية البكتيريا من انتقال البلازميدات والعدوى الفيروسية، ثم أُعيد توظيفها لاحقًا كأداة فعّالة لاستهداف الحمض النووي الريبوزي (DNA) في عملية تحرير الجينوم (جيانغ ودودنا، 2017). بالإضافة إلى ذلك، أشارت التقارير إلى وجود نظام CRISPR/Cas9 في 50% من جينومات البكتيريا و87% من جينومات العتائق (إيشينو وآخرون، 2018). يُعدّ CRISPR/Cas9 أداةً واعدةً لحذف وإدخال وتصحيح أي تسلسل جيني غير طبيعي باستخدام تقنيات حيوية (داخل الجسم الحي وخارجه) (سابيت وآخرون، 2021). علاوةً على ذلك، ثبت أن CRISPR/Cas9 جزءٌ من الجهاز المناعي التكيفي نظرًا لخصوصيته في استهداف الجينات ذات الأهمية (تشين وتشانغ، 2018).
يتكون نظام CRISPR/Cas9 من بروتين Cas9 وجزيء RNA مرشد واحد (sgRNA). يُعد Cas9 إنزيمًا نوويًا داخليًا يتألف من عدة مكونات بروتينية. بالإضافة إلى ذلك، يتميز Cas9 بخصائص بنيوية وتشكيلية فريدة (Pacesa et al., 2022) حيث يتكون من فصين: فص التعرف (REC) وفص النوكلياز (NUC). ينقسم فص REC إلى ثلاثة مناطق: REC1 وREC2 واللوالب الجسرية (Cromwell et al., 2018). يتكون فص NUC من ثلاثة فصوص، هي: RuvC (RuvC I وRuvC II وRuvC III) وHNH ونطاق تفاعل النمط المجاور للبروتوسبيسر (PAM) (الشكل 1) (Song et al., 2016). يتكون جزيء sgRNA من مكونين، هما RNA الخاص بنظام CRISPR (crRNA) وRNA صغير مشفر (tracer RNA) (الشكل 1). يربط الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) بروتين Cas9 بالكونكسينات لتكوين مُركّب نشط، يُعرف أيضًا باسم مُركّب المُؤثِّر (ريشتر وآخرون، 2012). يتكون الحمض النووي الريبوزي المُوجِّه (crRNA) من 18-20 زوجًا من القواعد النيوكليوتيدية، ويلعب دورًا حاسمًا في التعرّف على تسلسلات الحمض النووي المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك، يرتبط crRNA بالحمض النووي المستهدف، ويعمل tracrRNA كدعامة لإنزيم Cas9 النووي للارتباط بالحمض النووي المستهدف (مانغوار وآخرون، 2019). من ناحية أخرى، يحتوي تسلسل PAM على 3 نيوكليوتيدات، تُؤكّد وتُحدّد وتُسهّل ارتباط مُركّب المُؤثِّر بالحمض النووي. تمتلك الوحدات الفرعية لمُركّب بروتين Cas9، وهما RuvC وHNH، نشاطًا تحفيزيًا (ريشتر وآخرون، 2012؛ أسمامو وزودي، 2021). يقوم نطاق HNH النووي في الوحدة الفرعية Cas9 بقطع سلسلة الحمض النووي المرتبطة بـ crRNA. يقوم نطاق النيوكلياز RuvC بقطع خيوط الحمض النووي الأخرى ويولد فواصل مزدوجة السلسلة (DSBs)، وبعد ذلك يتم تنشيط آليتين مختلفتين لإصلاح فواصل الحمض النووي (جيانغ ودودنا، 2017) (الشكل 1).
الشكل 1. نظرة عامة على نظام CRISPR/Cas9 (أ). مكونات نظام CRISPR/Cas9: (1) إنزيم Cas9 الداخلي مسؤول عن قطع تسلسل الحمض النووي المستهدف، (2) جزيء RNA دليل مفرد (sgRNA) ناتج عن اندماج جزيئي crRNA وtra-crRNA الهجينين. (2) يتضمن Cas9 عدة مكونات مثل Rec I وRec II وفص NUC (يُعدّ كل من HNH وRuv C مكونين فرعيين) ونطاق تفاعل PAM (ج) بوظائفها المقابلة. يقوم مركب بروتين CRISPR/Cas9 بقطع تسلسلات الحمض النووي إلى أشكال غير متكاملة ومتكاملة (د). يُجري نظام CRISPR/Cas9 تعديلات على الجينوم في ثلاث مراحل: التعرف والقطع والإصلاح. يوجه جزيء sgRNA المصمم إنزيم Cas9 ويتعرف على التسلسل المطلوب من خلال المكون المكمل crRNA. يتعرف Cas9 على تسلسل PAM عند 5′-NGG-3′ ويفصل الحمض النووي، مكونًا هجين DNA-RNA ومنشطًا عملية القطع. يقوم نطاق HNH في بروتين Cas9 بقطع السلسلة المكملة، بينما يقوم نطاق RuvC بقطع السلسلة غير المكملة. يُصلح نظام CRISPR/Cas9 الحمض النووي المزدوج عن طريق كسره بطريقتين: الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). يُصلح الربط غير المتجانس للنهايات الحمض النووي المزدوج في غياب الحمض النووي المتماثل الغريب من خلال عملية إنزيمية، وهي آلية عرضة للخطأ قد تُدخل أو تُزيل تسلسلات عشوائية من الحمض النووي. أما الإصلاح الموجه بالتماثل فهو شديد التخصص ويتطلب قوالب من الحمض النووي المتماثل.
تشمل مسارات الإصلاح المعتمدة على تقنية كريسبر/كاس9 آليات الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). يُعدّ الربط غير المتجانس للنهايات مسارًا عرضةً للأخطاء لأنه يتضمن إدخال أو حذف نيوكليوتيدات ولا يتطلب أي نمط محدد أثناء عملية الإصلاح. يستخدم هذا المسار نيوكليوتيدات عشوائية لتوليد بروتينات قياسية (عباسي وآخرون، 2021). يتكون نظام الإصلاح هذا من أربعة مركبات، هي: مركب KU، ومركب البروتين المكمل المتبادل من النوع 4 (XRCC-4)، وإنزيم معالجة نهايات الحمض النووي، وبروتين كيناز DNA-PKcs (عباسي وآخرون، 2021). يتكون بروتين معقد KU من وحدتين فرعيتين، Ku 70 وKu 80، ويلعب دورًا هامًا في آلية إصلاح انقطاعات الحمض النووي غير المتجانسة (NHEJ)، حيث تبدأ هذه الآلية بارتباط هاتين الوحدتين الفرعيتين (Ku 70 وKu 80) بالنهايات غير المتجانسة أو شبه المتجانسة للحمض النووي المستهدف (عباسي وآخرون، 2021)، مما يوفر دعامة لاستقطاب عوامل أخرى مرتبطة بآلية NHEJ إلى موقع الإصابة (يانغ وآخرون، 2020). يتكون كل من XRCC-4 وإنزيم ربط الحمض النووي من 334 و911 حمضًا أمينيًا على التوالي، ويحفز معقد XRCC4-DNA ligase IV ربط نهايات الحمض النووي (تشاتيرجي وآخرون، 2015). يُعرف إنزيم معالجة نهايات الحمض النووي أيضًا باسم كيناز عديد النوكليوتيد 3′-فوسفات، وهو إنزيم متخصص في معالجة نهايات الحمض النووي. يستطيع هذا الإنزيم إزالة مجموعة 3′P من الحمض النووي وفسفرة مجموعة 5′OH أثناء إصلاح انقطاعات الحمض النووي المزدوجة (DSB). يتضمن ذلك أيضًا إصلاح انقطاعات السلسلة المفردة (SSBs) باستخدام مسار إصلاح انقطاعات السلسلة المفردة (Chatterjee et al., 2015). يُعد بروتين كيناز DNA-PKcs كينازًا بروتينيًا يعتمد على الحمض النووي، ويتكون من وحدة فرعية محفزة من عائلة PIKKs (كينازات مرتبطة بكيناز فوسفاتيديلينوسيتول 3) وعائلة ATM (كينازات الطفرة في رنح توسع الشعيرات)، بالإضافة إلى ATRs المرتبطة بـ ATM وRad3. كما يشمل إصلاح انقطاعات السلسلة المزدوجة (DSBs) وانقطاعات السلسلة المفردة (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
تُعدّ آلية إصلاح الحمض النووي المتماثل (HDR) أكثر دقةً وملاءمةً، إذ تُنسخ المعلومات باستخدام الشكل السليم لجزيء الحمض النووي المزدوج المتماثل، على الرغم من أنها تتطلب وجود الكروماتيدات الشقيقة. ويحدث هذا خلال طور S/G2 من دورة الخلية في الثدييات. تحدث آلية HDR بشكل رئيسي في أنواع الخميرة، بينما تُعدّ آلية إصلاح الحمض النووي غير المتماثل (NHEJ) بالغة الأهمية في الثدييات (بورما وآخرون، 2006؛ عباسي وآخرون، 2021). يوضح الشكل 1 آلية الإصلاح الكاملة.
بما أن سرطان الثدي الثلاثي السلبي ينتج عن تشوهات جينية وفوق جينية، فإن تصحيح التشوهات الجينومية/فوق الجينية الخبيثة باستخدام تقنية كريسبر/كاس9 قد يكون نهجًا علاجيًا مناسبًا (تشين وآخرون، 2019). إضافةً إلى ذلك، قد تُظهر بعض عوامل النسخ المشاركة في تنظيم النسخ الخاص بالخلايا خصائص فريدة للخلايا السرطانية، مما يشير إلى أن تنظيم النسخ قد يكون نهجًا ممتازًا لعلاج السرطان (دروست وآخرون، 2017). إن استغلال هذه الخصائص الجزيئية للأورام، مثل العيوب الجينية والفوق جينية والنسخية، لتطوير الأدوية يمكن أن يُحسّن النتائج السريرية ويُقلل تكاليف الفحص. تُعد تقنية كريسبر أداةً محتملةً لتحرير الجينات، لا تقتصر وظيفتها على الكشف عن الأهداف الجينومية المُسببة للسرطان وتحديدها فحسب، بل يمكن استخدامها أيضًا لتحرير الجينات الورمية وكبحها وتعديلها فوق جينيًا في الخلايا البشرية (الجدول 1) (أحمد وآخرون، 2021). وقد أُجريت العديد من عمليات فحص كريسبر للبحث عن الجينات المرتبطة بكوابح الأورام والجينات الورمية ومقاومة الأدوية. يوضح الشكل 2 استخدام تقنية CRISPR/Cas9 لتعديل جينات الأورام السرطانية المختلفة في سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
الشكل 2. تعديل الجينات الورمية المختلفة لسرطان الثدي الثلاثي السلبي باستخدام تقنية كريسبر/كاس9، مما أدى إلى تقليل نمو الورم وانتشاره. تشمل هذه الجينات الورمية CDK7 وNAT1 وUBR5 وYTHDF2 وITGA9 وCXCR4 وCXCR7 وCrypto1 وROR1 وST8SIA، والتي تُشارك في حدوث سرطان الثدي الثلاثي السلبي وانتشاره.
ترتبط هجرة الخلايا السرطانية وغزوها وتحولها الظهاري-الميزانشيمي (EMT) بجين ITGA9. وقد أظهرت دراسات سابقة أن ITGA9 عنصر أساسي في مسار Notch، ويلعب دورًا هامًا في انتشار ورم العضلات المخططة (Molist et al., 2020). بالإضافة إلى ذلك، وُجد أن ITGA9 يرتبط ارتباطًا وثيقًا بتوقعات سير المرض لدى المرضى في أنواع عديدة من الأورام، بما في ذلك سرطان الثدي (Wang Z. et al., 2019). كما أظهر تحليل المعلوماتية الحيوية لـ ITGA9 أن تعبيره في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) أعلى بكثير من تعبيره في الأنواع الفرعية الأخرى من سرطان الثدي. وترتبط المستويات المرتفعة من ITGA9 بانتشار الورم وانتكاسه لدى مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي. وقد أدى تعطيل جين ITGA9 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 إلى ظهور خصائص شبيهة بالخلايا الجذعية السرطانية (CSC)، وتكوين أوعية دموية جديدة في الورم، ونمو الورم، وانخفاض انتشاره عن طريق تعزيز تحلل β-catenin في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Wang Z. et al., 2019).
يُعدّ كريبتو-1 أحد أفراد عائلة TGF-β، وهو ضروريٌّ لتكوين الجنين المبكر، والحفاظ على الخلايا الجذعية، وانتشار السرطان (إيشي وآخرون، 2021). يُعرف أيضًا باسم Tdgf-1، وهو بروتين إشاري مُسرطن مُرتبط بـ GPI، ويشارك في تنظيم تكوين الخط البدائي، والأديم المتوسط، والأديم الباطن، بالإضافة إلى تحديد التناظر بين الجانبين الأيمن والأيسر في نمو أعضاء الجسم خلال التكوين الجنيني (تشانغ وآخرون، 2021ب). علاوة على ذلك، ثبت أن كريبتو-1 يشارك في التحول الظهاري-الميزانشيمي (EMT) كعلامة للخلايا الجذعية (تشانغ وآخرون، 2021ب). يُعدّ التحول الظهاري-الميزانشيمي ضروريًّا ليس فقط لعملياتٍ مختلفةٍ مثل نمو الجنين، والتليف، والتئام الجروح، بل أيضًا لغزو السرطان وانتشاره. بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن بروتين كريبتو-1 يتفاعل مع أربعة مستقبلات نوتش ويعزز نضجها بعد الترجمة (براندشتاتر ومايلارد، 2019). ومن المعروف أن مسار إشارات نوتش يشارك في الحفاظ على خلايا سرطان الثدي البشري. وقد أظهرت الدراسات أن تعطيل جين كريبتو-1 باستخدام تقنية كريسبر/كاس9 يثبط نمو السرطان وانتشاره. لذلك، قد يصبح كريبتو-1 هدفًا علاجيًا مهمًا لسرطان الثدي الثلاثي السلبي (كاسترو وآخرون، 2015).
يلعب بروتين XCL12 ومستقبله الكيميائي CXC (CXCR4 وCXCR7) أدوارًا متعددة في تكاثر الخلايا السرطانية ونموها وهجرتها وغزوها (Wu et al., 2015). وقد ارتبطت هذه المستقبلات الكيميائية بتطور سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) عبر مسارات إشارات متعددة في كل من النماذج الحية والمخبرية (Wu et al., 2015). بالإضافة إلى ذلك، يرتبط تنشيط CXCR4 وCXCR7 بزيادة قابلية الإصابة بالنقائل وسوء التشخيص في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Karn et al., 2022). لذلك، قد يصبح تعطيل جينات CXCR4 وCXCR7 هدفًا دوائيًا فعالًا لعلاج سرطان الثدي، بما في ذلك سرطان الثدي الثلاثي السلبي. (دراسة Yang et al.) استخدم يانغ وآخرون (2019) تقنية CRISPR/Cas9 لإيقاف جينات CXCR4 وCXCR7 ووجدوا أن تكاثر ونمو وهجرة وغزو سرطان الثدي الثلاثي السلبي قد تم تثبيطه بشكل كبير (يانغ وآخرون، 2019).
لوحظ ارتفاع مستويات miR-3662، وهو جين ورمي في سرطان الثدي الثلاثي السلبي، في أنسجة سرطان الثدي (يي وآخرون، 2022). وقد ثبت أن تثبيط miR-3662 يمنع نمو ورم سرطان الثدي وانتشاره في الجسم الحي وفي المختبر (أغاروال وغوبتا، 2021). يُعد HBP-1 مثبطًا قويًا لإشارات Wnt/βcatenin، ومن المرجح أنه مسؤول عن نمو خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي بوساطة miR-3662. وقد وجد يي وآخرون مؤخرًا أن محور miR-3662-HBP1 ينظم مسار إشارات Wnt/βcatenin في خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي (يي وآخرون، 2022). ونظرًا لتعبيره النوعي في الورم، قد يكون miR-3662 هدفًا علاجيًا محتملاً لسرطان الثدي الثلاثي السلبي. وبالتالي، فإن إسكات miR-3662 بواسطة CRISPR/Cas9 قد يكون نهجًا ممتازًا لتطوير أدوية جديدة لعلاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
يُعدّ UBR5 بروتينًا نوويًا فوسفاتيًا بوزن 300 كيلو دالتون، وقد تمّ تحديده كمنظم رئيسي لتكوّن الأورام، وانتشارها، والاستجابة المناعية في أنواع مختلفة من السرطانات (شيرر وآخرون، 2015؛ فو وآخرون، 2023). وقد أُفيد بأنّ UBR5 يرتفع بشكل ملحوظ في عينات سرطان الثدي الثلاثي السلبي، ويحفز وظيفة مستقبلات هرمون الإستروجين ألفا (ERα) عن طريق تحفيز التكاثر من خلال نشاطه كإنزيم ليغاز اليوبيكويتين (بولت وآخرون، 2015). كما أظهرت دراسات تسلسل الإكسوم الكامل لعينات سرطان الثدي الثلاثي السلبي الأولية زيادة في التعبير عن UBR5، مما يشير إلى دوره في تطور هذا النوع من السرطان. بالإضافة إلى ذلك، أظهر حذف UBR5 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 تثبيطًا كبيرًا لانتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي ونموه في نماذج الفئران التجريبية. علاوة على ذلك، أدى إدخال UBR5 في نموذج فأر من النوع البري إلى استعادة وظيفته الكاملة، بينما لم يُلاحظ هذا التأثير في سلالات الفئران الطافرة المعطلة (ليا وآخرون، 2017). يرتبط نقص UBR5 بزيادة موت الخلايا المبرمج، والنخر، وتثبيط نمو الورم في سرطان الثدي الثلاثي السلبي نتيجة ضعف تكوين الأوعية الدموية. وبسبب فقدان UBR5، يقل انتشار الورم إلى الأعضاء البعيدة، ويحفز UBR5 تحولًا ظهاريًا-ميزانشيميًا غير طبيعي، وذلك بشكل رئيسي عن طريق تقليل التعبير عن E-cadherin (Zhang and Weinberg, 2018). وقد تبين مؤخرًا أن UBR5 عامل بالغ الأهمية في نسخ PDL1 المحفز بواسطة IFN-γ في سرطان الثدي الثلاثي السلبي، نظرًا لافتقاره إلى نشاط اليوبيكويتين E3. وكشف تحليل النسخ الجيني للرنا أن UBR5 قد يكون له تأثيرات جهازية على الجينات المرتبطة بمسار IFN-γ، ويعزز تنشيط PDL1 عن طريق زيادة مستويات تنشيط بروتين كيناز الرنا (PKR) ومحولات الإشارة ومنشطاته، مثل STAT1 وIRF1. مع ذلك، فإن التثبيط المشترك لتعبير كل من UBR5 وPD-L1 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 يُظهر تأثيرًا علاجيًا تآزريًا يفوق تأثير تثبيط أي منهما على حدة، مع تأثيرات عميقة على البيئة الدقيقة للورم (Wu et al., 2022). لذا، قد تكون تقنية CRISPR/Cas9 أداةً مهمةً لتثبيط وظيفة UBR5، وبالتالي كبح انتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي ونمو الورم.
يُعدّ ROR1 بروتينًا غشائيًا من النوع الأول، يُعبَّر عنه أثناء السرطان والتطور الجنيني، وقد صُنِّف كبروتين جنيني ورمي (نيكولاس بورشردينغ، 2014). يرتبط السلوك الغازي لأنواع مختلفة من السرطانات البشرية بزيادة التعبير عن ROR1. وقد حُصِلت على نتائج واعدة من دراسات أجريت على الحيوانات الحية وفي المختبر باستخدام مركبات علاجية تستهدف ROR1 (تشين وآخرون، 2016). كما رُبطت المستويات المرتفعة من mRNA الخاص بـ ROR1 في خزعات أنسجة الثدي بأورام الثدي القاعدية العدوانية (BL) وهجرتها إلى أجزاء أخرى من الجسم. علاوة على ذلك، حُدِّد فرط التعبير عن ROR1 كعلامة تنبؤية لتطور سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) (تشين وآخرون، 2016). مع ذلك، يُعدّ إسكات ROR1 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 لكبح نمو سرطان الثدي الثلاثي السلبي وانتشاره استراتيجية فعالة.
تتضمن عملية السيالة إضافة حمض السياليك إلى جزيئات الغليكوكونجوجات، وهي عملية تحفزها إنزيمات السياليل ترانسفيراز (STs). ينتمي إنزيم ST8SIA1 إلى عائلة إنزيمات السياليل ترانسفيراز، ويلعب دورًا هامًا في إمراضية العديد من الأمراض، مثل سرطان الدم الليمفاوي وسرطان القولون والمستقيم (تشانغ وآخرون، 2018). يُظهر تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) أن إنزيم ST8SIA1 يُعبر عنه بكثرة في أنسجة الثدي لدى مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC)، ويرتبط ارتباطًا إيجابيًا بالطفرات في جين كابت الورم p53، مما قد يُساهم في إمراضية سرطان الثدي الثلاثي السلبي (باتولا وآخرون، 2017). بالإضافة إلى ذلك، يُشارك إنزيم ST8SIA1 في انتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي وتكراره، مما يُشير إلى دوره الهام في حدوثه وتطوره. في نموذج مخبري لسرطان الثدي الثلاثي السلبي، تبين أن تثبيط جين ST8SIA1 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 يمنع نمو الورم وانتشاره (باتولا وآخرون، 2017). يشير هذا إلى أن تقنية CRISPR/Cas9 قد تكون أداة مهمة لتثبيط وظيفة جين ST8SIA1 المسرطن في علاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
إنزيم NAT1 هو إنزيم أيضي يحفز تكوين مركبات غريبة من المرحلة الثانية، ويُعبر عنه في جميع أنسجة الجسم البشري تقريبًا. يستطيع NAT1 استخدام عامل الفولات المساعد لاستهداف أسيتيل-CoA (أسيتيل-CoA) حتى في غياب ركيزة الأمين العطري (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). أظهرت الدراسات أن NAT1 ينظم وظيفة ميتالوبروتينيز المصفوفة 9 (MMP9) في نماذج خلايا سرطان الثدي، ويحمي من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أثناء نقص الجلوكوز (Wang et al., 2018). كما تبين أن حذف NAT1 يثبط مركب نازعة هيدروجين البيروفات، مما يؤدي إلى خلل في وظيفة الميتوكوندريا (Wang L. et al., 2019). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت تقارير أخرى عديدة أن تثبيط إنزيم NAT1 باستخدام جزيئات صغيرة وتقنية إسكات الجينات siRNA يُمكن أن يُقلل من قدرة خلايا سرطان الثدي على غزو الأنسجة وانتشارها (ستيب وآخرون، 2018). ومؤخرًا، استُخدمت تقنية CRISPR/Cas9 لكبح إنزيم NAT1 في سلالة خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231، مما يؤثر على عملية الأيض الخلوي تبعًا لمستوى تعبيره. كما أظهرت هذه الدراسة أن إنزيم NAT-1 ضروري لتطور وانتشار سرطان الثدي الثلاثي السلبي (كارلايل وآخرون، 2020).
تُنظَّم عملية النسخ المنسقة للجينات الورمية بواسطة مُحسِّنات فائقة، وعوامل نسخ، وعوامل مساعدة (Hnisz et al., 2015). إضافةً إلى ذلك، تُعدُّ مجموعة من الكينازات المعتمدة على السيكلين (CDKs)، مثل CDK7 وCDK8 وCDK9 وCDK12 وCDK13، ضروريةً لتنظيم النسخ. ومن بينها، يُشارك CDK7 في فسفرة بوليميراز الحمض النووي الريبي II، وهو أمرٌ بالغ الأهمية لبدء وتوسع نسخ الجينات الورمية في نشأة سرطان الثدي الثلاثي السلبي. في دراسة رائدة، أدى حذف CDK7 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 إلى تثبيط سرطان الثدي الثلاثي السلبي، مما يُشير إلى أنَّ نشأة هذا النوع من السرطان تعتمد على CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
أظهرت الدراسات أن الطفرات في جيني MYC وRBP (بروتين ربط الحمض النووي الريبي) قد تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج، بينما لا تؤثر الطفرات الجينية المفردة في أيٍّ من الجينين على نمو الخلايا السرطانية (أينشتاين وآخرون، 2021). وقد تم فحص أكثر من 1000 بروتين ربط الحمض النووي الريبي في الجينوم البشري باستخدام مكتبة تعتمد على تقنية CRISPR/Cas9. ومن بينها، وُجد أن 57 بروتين ربط الحمض النووي الريبي ضرورية لنمو الخلايا السرطانية ذات المستويات المرتفعة جدًا من جين MYC (ويلر وآخرون، 2020). بالإضافة إلى ذلك، يُعدّ YTHDF2 مهمًا للحفاظ على نمو خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي، ويقلل من كمية النسخ المُمَثْيَلَة أثناء النسخ والترجمة عاليي المستوى في الخلايا السرطانية ذات التعبير العالي عن جين MYC. بالإضافة إلى ذلك، فإن YTHDF2 ليس ضروريًا للخلايا السرطانية، والتي تعتمد بشكل أقل على مستويات MYC المرتفعة لإطالة بقاء مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Einstein et al.، 2021)، مما يشير إلى أنه قد يكون هدفًا علاجيًا محتملاً للأدوية التي يمكنها التغلب على سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
تشكل بروتينات الزنك (ZNFs) ما يقارب 1% من إجمالي الجينوم البشري. وقد أظهرت الدراسات أن بروتينات الزنك قادرة على تنظيم تكاثر الخلايا في أنواع مختلفة من السرطانات، مثل سرطان الكبد وسرطان الثدي وسرطان القولون والمستقيم (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). استُخدمت مكتبات مُولّدة بتقنية CRISPR لحذف الجينات لفحص العديد من جينات كبت الأورام (TSGs) في خلايا سرطان الثدي (Shalem et al., 2014). ومنذ ذلك الحين، أظهرت دراسة جينومية لخلايا سرطان الثدي المحذوفة منها جين ZNF319 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 أن ZNF319 هو جين كابت للأورام يُقلل من تكاثر خلايا سرطان الثدي، وبالتالي فهو يشارك في آليات إشارات محتملة ووظائف بيولوجية أخرى (Wang L. et al., 2022).
موت الخلايا الحديدي هو نوع من الموت الخلوي المبرمج يعتمد على وجود الحديد. ومن المعروف أن تطور موت الخلايا الحديدي يتأثر بوجود بيروكسيدات الدهون. بالإضافة إلى ذلك، أشارت التقارير إلى أن بروتين كيناز C بيتا 2 (PKCβII) يُظهر بيروكسدة الدهون في مراحلها المبكرة، وأن زيادة بيروكسدة الدهون ترتبط بموت الخلايا الحديدي. وقد كشف فحص مكتبة مثبطات الكيناز المعتمدة على تقنية كريسبر/كاس9 أن PKCβII يشارك في عملية بيروكسدة الدهون، وهي عملية حاسمة لموت الخلايا الحديدي في خلايا MDA-MB-231 (تشانغ وآخرون، 2022). لذلك، يشير هذا إلى أن تعطيل جين PKCβII باستخدام تقنية كريسبر/كاس9 قد يكون هدفًا محتملاً لجين كابت للورم لعلاج الأمراض المرتبطة بموت الخلايا الحديدي (تشانغ وآخرون، 2022).
يُعتقد أن مقاومة الأدوية مسؤولة عن حوالي 90% من وفيات مرضى السرطان، وهي من أبرز التحديات في علاج السرطان (بوكوفسكي وآخرون، 2020). تشير النتائج إلى أن عددًا كبيرًا من الجينات المرتبطة بإخراج الأدوية، وإصلاح الحمض النووي، والاستماتة الخلوية، ومسارات الإشارات الخلوية المختلفة، ترتبط بمقاومة الأدوية (حيدر وآخرون، 2020). من بين هذه الجينات، استُهدفت عدة جينات باستخدام تقنية كريسبر/كاس9، وأظهرت نتائج واعدة في الحد من مقاومة الأدوية وزيادة فعالية علاجات السرطان (فاغاري-تاباري وآخرون، 2022). إضافةً إلى ذلك، استُخدمت مكتبات فحص تعطيل الجينات بتقنية كريسبر/كاس9 عالية الإنتاجية في تعديل وظيفة الجينات المستهدفة المحتملة لمقاومة الأدوية (شاليم وآخرون، 2015). لتحديد جينات مقاومة الباكليتاكسيل، استُخدم تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) المقترن بفحص مكتبة الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) على مستوى الجينوم لتحديد ثمانية جينات مرشحة، بما في ذلك هيستون دي أسيتيلاز 9 (HDAC9)، المرتبطة بمقاومة الأدوية لدى المرضى المصابين بسرطان الثدي الثلاثي السلبي المتكرر (B et al., 2020). في دراسة أخرى، لوحظ ازدياد في التعبير عن بروتين كيناز ثنائي السيرين/ثريونين والتيروسين (DSTYK) خلال فترة بقاء مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي الذين عولجوا بأدوية مضادة للسرطان. علاوة على ذلك، أدى تثبيط DSTYK بواسطة تقنية CRISPR/Cas9 إلى تعزيز موت الخلايا المبرمج بشكل ملحوظ في الخلايا السرطانية المقاومة للأدوية في المختبر (خلايا SUM102PT وخلايا MDA-MB-468) وفي نموذج حيواني لسرطان الثدي الثلاثي السلبي (Ogbu et al., 2021).
على الرغم من أن سرطان الثدي الثلاثي السلبي يُظهر تنشيطًا غير طبيعي لمسار MAPK، إلا أن التأثير السريري للعلاجات المُستهدفة لـ MEK ضعيف. كشف فحص مكتبة جينومية باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 أن تثبيط PSMG2 (بروتين مُرافق تجميع البروتينات 2) يزيد من حساسية خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي BT549 وMB468 لمثبط MEK، AZD6244. أدى تثبيط PSMG2 باستخدام CRISPR/Cas9 إلى تغيير وظيفة البروتيازوم الطبيعية، مما أدى إلى تفكك PDPK1 بوساطة الالتهام الذاتي، وبالتالي تحسين حالة الخلايا السرطانية في نماذج الفئران المصابة بسرطان الثدي الثلاثي السلبي المُحفزة بواسطة AZD6244 (مثبط MEK) وMG132 (مثبط البروتيازوم). لذا، يُمكن استخدام مثبطات البروتيازوم وMAPK (MEK) بشكل تآزري للحد من تكاثر الخلايا السرطانية (وانغ وآخرون، 2022).
استُخدمت تقنية CRISPR/Cas9 أيضًا للكشف عن فقدان وظيفة الجينات المؤدي إلى مقاومة سرطان الثدي الثلاثي السلبي (شو وآخرون، 2020). أوضح جي وآخرون آلية مقاومة الخلايا السرطانية للأدوية المعالجة بـ JQ1، وهو مثبط لنطاق برومين BET (BBDI)، في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. باستخدام تقنية CRISPR/Cas9، وجدوا أن حذف جين rb1 يُسبب مقاومة سرطان الثدي الثلاثي السلبي لدواء JQ1 المضاد للسرطان. لذلك، تُعد وظيفة rb1 مهمة في الاستجابة لأدوية JQ1 في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. كما أفادوا بأن باكليتاكسيل هو مثبط لكيناز CDK4/6/الأنابيب الدقيقة، وأن دمجه مع مثبطات نطاق برومين BET مثل JQ1 قد يوفر استجابات علاجية واعدة لسرطان الثدي الثلاثي السلبي المقاوم للأدوية (جي وآخرون، 2020).
أُشير إلى أن النمط الجيني للرنا غير المشفر الطويل (lncRNA) مسؤول عن مقاومة العلاج المساعد الجديد في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC). تُظهر هذه الدراسة أن خمسة نسخ مختلفة من mALAT1 lncRNA تُعبر عنها خلايا TNBC بكثافة عالية. بالإضافة إلى ذلك، أدى حذف mALAT1 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 إلى زيادة حساسية خلايا BT-549 المصابة بسرطان الثدي الثلاثي السلبي لعقاري باكليتاكسيل ودوكسوروبيسين، مما يُشير إلى دور محتمل لمقاومة mALAT1 في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Shaath et al., 2021).
تُعدّ الطفرات في جين BRCA1 (BRCA1m) غير متجانسة، ولذلك يصعب اكتشافها. قد يؤدي استهداف PARP1 (بوليميراز عديد (أدينوزين ثنائي الفوسفات-ريبوز))، الشريك القاتل التركيبي لـ BRCA1، إلى زيادة حساسية سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) للعلاج الكيميائي. باستخدام تقنية CRISPR/Cas9، أدى حذف PARP1 إلى زيادة حساسية خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي الحاملة لطفرة mBRCA1 للأدوية المضادة للسرطان، مثل دوكسوروبيسين وجيمسيتابين ودوسيتاكسيل، مما يشير إلى أن PARP1 يشارك أيضًا في مقاومة الأدوية في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Vaghari-Tabari et al., 2022). من المعروف أن الطفرات في جينات كابتة الأورام BRCA1 أو BRCA2 تزيد من احتمالية الإصابة بسرطان الثدي لدى البشر. ويتطلب علاج هؤلاء المرضى استخدام مثبطات PARP. بالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت أن تعطيل عامل استعادة النيوكليوتيدات DNPH1 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 يُمكن أن يُزيل النيوكليوتيد السام 5-هيدروكسي ميثيل ديوكسي يوريدين (hmdU) أحادي الفوسفات، مما يُعزز استجابة الخلايا التي تعاني من نقص BRCA لمثبطات PARP (فوغر وآخرون، 2021). وبالتالي، قد تُصبح تقنية CRISPR/Cas9 ومثبطات PARP1 استراتيجية علاجية مهمة لسرطان الثدي الثلاثي السلبي.
يُعدّ جين البروتين السكري المخترق (P-gp) جينًا مقاومًا للأدوية المتعددة، ويُلاحظ ارتفاع تعبيره في حوالي 41% من حالات سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Sun et al., 2020). وقد حُدِّد تدفق الدواء الناتج عن P-gp كعامل رئيسي في تنظيم مقاومة الأدوية في سرطان الثدي. كما أظهرت مثبطات P-gp زيادة في حساسية سرطان الثدي للأدوية المضادة للسرطان (Famta et al., 2021). لذا، قد يكون استئصال أو تثبيط P-gp باستخدام تقنية CRISPR/Cas9، بالإضافة إلى مثبطات P-gp، من الطرق المهمة جدًا للتغلب على مقاومة الأدوية في سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
من المعروف أن ناقل كاسيت ربط ATP G2 (ABCG2) يُسبب مقاومة الأدوية في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Palasuberniam et al., 2015)، على الرغم من عدم وجود تقارير حاليًا حول العلاقة بين تقنية CRISPR/Cas9 وإسكات ABCG2 وتعطيل جينات كابتة الأورام. قد يُعزز PTEN تنشيط ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015)، (Deepak Singh et al., 2021). لذلك، قد يكون استخدام CRISPR/Cas9 لإزالة ABCG2 ودمجه مع مُثبِّط ABCG2 علاجًا مناسبًا للتغلب على مقاومة الأدوية في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. يوضح الجدول 2 استهداف CRISPR/Cas9 لجميع جينات المقاومة.
الجدول 2. يستهدف نظام CRISPR/Cas9 جينات مقاومة سرطان الثدي الثلاثي السلبية المختلفة لتحسيس الخلايا للأدوية المضادة للسرطان.
تُعدّ مكتبات CRISPR/Cas9 أدواتٍ واعدةً لفحص الطفرات الجينية المرتبطة بتكوّن السرطان (تشان وآخرون، 2022). تتضمن هذه الطريقة أربع خطوات: (أ) بناء المكتبة، (ب) النقل الفيروسي البطيء، (ج) الفحص الظاهري، و(د) تحليل الجينات المستهدفة. على الرغم من أن سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) يُظهر تنشيطًا غير طبيعي لمسار MAPK، إلا أن التنبؤ السريري للعلاج الموجّه لـ MEK لمرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي الذين يحملون طفرات في جينات كابتة للأورام مثل PTEN وRB1 وTP53 ضعيفٌ للغاية.
بالإضافة إلى ذلك، اختبرت دراسة تعطيل الجينات باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 جزيء ديهيدروكاترول، وهو الجزيء الأكثر فعالية وانتقائية، والمتوفر بكثرة في مستخلصات الزهور والأوراق الغواتيمالية، لفهم تأثيره على خلايا MDA-MB-231. وتناولت الدراسة آليات السمية الخلوية الانتقائية، وخصائص الخلايا الجذعية الوسيطة لأنواع فرعية من سرطان الثدي الثلاثي السلبي. كما كشفت هذه الدراسة القائمة على تقنية CRISPR/Cas9 أن جين HSD17B11، الذي يرمز إلى إنزيم 17β-هيدروكسيستيرويد ديهيدروجينيز من النوع 11، يُعبر عنه بكثرة في خلايا MDA-MB-231، وينتج عنه ديهيدروفالكارينول خاص بهذه الخلايا (Grant et al., 2020). وبالتالي، يشير هذا إلى أن الفحص الجينومي باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 يمتلك إمكانات كبيرة في تحديد الآليات الكامنة وراء الخصائص المضادة للسرطان للمركبات الطبيعية المحتملة.
بالإضافة إلى ذلك، دُرست قابلية سرطان الثدي الثلاثي السلبي للإصابة بالسرطان باستخدام فحص CRISPR/Cas9 غير متحيز على مستوى الجينوم في الجسم الحي، والذي أظهر وجود صلة بين مسارات الجينات المسرطنة ومسارات الجينات الكابتة للأورام. وقد أشارت التقارير إلى أن المكونات الرئيسية لمساري mTOR وHippo تلعب أدوارًا مهمة في تنظيم الورم في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات أن التثبيط الدوائي لـ mTORC1/2 وبروتين YAP الورمي يثبط بشكل فعال مرضية سرطان الثدي الثلاثي السلبي باستخدام نموذج تآزر الدواء مع المصفوفة في المختبر وزرع الأورام المشتقة من المرضى في الجسم الحي. كما أن تثبيط mTORC1/2 بوساطة Torin-1 يعزز عملية البلعمة الكبيرة، بينما يؤدي تثبيط YAP الناتج عن verteporfin إلى موت خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي. وبشكل عام، تُبرز هذه النتائج قوة وفعالية فحص CRISPR على مستوى الجينوم في الجسم الحي لتحديد علاجات جديدة وفعالة لسرطان الثدي الثلاثي السلبي (Dai et al., 2021).
يُعدّ اضطراب الجهاز المناعي عاملاً مهماً في تكوّن الأورام. تتجنب الخلايا السرطانية التخلص المناعي عن طريق تجاوز آليات الدفاع، بما في ذلك التدخل في نشاط الخلايا المناعية في البيئة الدقيقة للورم وإضعاف الجهاز المناعي. لذا، قد يكون تطوير جهاز مناعي مُحسّن نهجاً أساسياً لمكافحة الأورام. يُعالج استخدام تقنية تعديل الجينات CRISPR/Cas9 العديد من المشكلات المتعلقة بخلل المناعة من زوايا مختلفة. وقد استُخدمت هذه التقنية لتحسين المناعة المضادة للأورام ضد سرطان الثدي عبر المسارات الموضحة في الشكل 3.
الشكل 3. يستهدف العلاج المناعي بتقنية CRISPR/Cas9 خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي. يؤدي فقدان CDK5 وتثبيط PDL1 وCD155 إلى تعزيز الجهاز المناعي. وبالمثل، فإن فقدان A2AR وتثبيط مستضدات الأورام المرتبطة بالخلايا التائية (TAAs) مثل HER2 وmucin 1 وTEM8 يزيد من فعالية خلايا CAR-T في قتل الخلايا السرطانية. وقد أظهر فحص الخلايا التائية باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 أن تعطيل كيناز p38 يعزز نشاط الخلايا التائية المضاد للأورام. تزيد الخلايا التائية المعدلة بتقنية CRISPR/Cas9 من التعبير عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR)، مما يؤدي إلى امتلاكها نشاطًا مضادًا للأورام.
يهدف العلاج المناعي إلى تحفيز الجهاز المناعي لمهاجمة الخلايا السرطانية. عادةً ما يمنع فرط التعبير عن بروتينات نقاط التفتيش المناعية حدوث تفاعلات المناعة الذاتية، ولكنه قد يساعد السرطانات على تجنبها (توباليان وآخرون، 2015). تمنع هذه البروتينات التفاعلات المناعية عن طريق الارتباط بمستقبلات على سطح الخلايا المناعية. تستهدف العديد من بروتينات نقاط التفتيش (مثل CD155 وPD-L1) مستقبل PD-1 على الخلايا المناعية، ويتم التعبير عنها في سرطان الثدي، وخاصةً سرطان الثدي الثلاثي السلبي (لي وآخرون، 2020). يمكن أن يؤدي تثبيط PD-L1 أو مستقبله باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 إلى تحفيز الجهاز المناعي لمهاجمة أورام سرطان الثدي الثلاثي السلبي (ياهاتا وآخرون، 2019). بالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت أن خفض مستوى التعبير عن PD-L1 من خلال حذف CDK5 بوساطة CRISPR/Cas9 يثبط نمو الورم في المختبر وفي الجسم الحي (دينغ وآخرون، 2020). يشير تثبيط النمو في نماذج سرطان الثدي في المختبر وفي الجسم الحي إلى أن تقليل CD155 بوساطة shRNA قد يكون له تأثير علاجي على سرطان الثدي (Gao et al.، 2018).
تُعبّر خلايا CAR T عن مستقبلات CAR التي تتعرف على المستضدات المرتبطة بالأورام (TAAs)، ويمكنها استخدام تثبيط بروتينات نقاط التفتيش المناعية لتعزيز نشاطها (Li C. et al., 2020). توجد أهداف محتملة متعددة لعلاج سرطان الثدي بخلايا CAR T، بما في ذلك العديد من المستضدات المرتبطة بالأورام مثل HER2 وmucin1 وTEM8 (Bajgain et al., 2018). وتشير الأدلة إلى أن خلايا CAR T التي تستهدف الميزوثيلين (المفرط التعبير في خلايا TNBC BT-459) تكون أكثر فعالية ضد السرطان عند تعطيل PD-1 باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). ومع ذلك، فإن عزل الخلايا التائية من المرضى ثم تعديلها خارج الجسم الحي عملية شاقة وتستغرق وقتًا طويلاً. على الرغم من أن الخلايا التائية العامة تُقلل من متطلبات العزل، إلا أنه ينبغي إزالة الخلايا التائية المانحة التي تُعبر عن مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) من الفئة الأولى ومستقبلات الخلايا التائية (TCR) لمنع حدوث خلل في استجابة الطعم ضد المضيف (Ren et al., 2017، 2017a). باستخدام تقنية CRISPR/Cas9، يُمكن لتقنية HDR إزالة كل من TCR وHLA في آنٍ واحد، بالإضافة إلى تعطيل الجين المُشفّر لمستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR). وقد أظهرت الدراسات إمكانية استخدام CRISPR/Cas9 لإدخال مستقبلات CAR المضادة لـ CD19 في موضع TCR، مما يُنتج مستقبلات CAR بكفاءة عالية دون استنزاف الخلايا التائية (Dimitri et al., 2022). وقد طُوّرت تقنيات متعددة لإنتاج خلايا CAR T غيرية المنشأ عن طريق إزالة TCR، وبيتا-2-ميكروغلوبولين (B2M)، والوحدة الفرعية HLA-I، وبروتينات أخرى مثل PD-1 وCTLA-4، والتي قد تمتلك خصائص مضادة للسرطان أقوى. ضد TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
قد يُحسّن استخدام تقنية CRISPR/Cas9 من فعالية خلايا CAR-T. من المعروف أن الأدينوزين يمتلك خصائص مثبطة للمناعة، ويمكنه تقليل المناعة المضادة للسرطان عن طريق تثبيط وظيفة الخلايا التائية وتنشيط مستقبلات الأدينوزين A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). وقد أدى إسكات A2AR باستخدام CRISPR/Cas9 إلى تحسين فعالية خلايا CAR-T بشكل ملحوظ في الجسم الحي (Giuffrida et al., 2021). من المعروف أن الخلايا التائية تُظهر خصائص ظاهرية متنوعة، مثل التوسع الخلوي، والتمايز، والإجهاد التأكسدي، والإجهاد الجيني. كشف فحص الخلايا التائية باستخدام CRISPR/Cas9 عن تعطيل 25 كينازًا مختلفًا لمستقبلات الخلايا التائية. ومن بينها، ثبت أن حذف كيناز p38 يُعزز النشاط المضاد للأورام للخلايا التائية، مما يشير إلى أن كيناز p38 هو منظم رئيسي لتنظيم خلايا CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
يمكن تعديل الخلايا التائية وراثيًا باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 لإنتاج مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) عالية التعبير. وقد أظهر نقل الخلايا التائية المعدلة وراثيًا إلى المرضى نشاطًا مضادًا للسرطان أقوى من الخلايا التائية الذاتية. لذلك، قد تتنافس مستقبلات الخلايا التائية الذاتية مع مستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيًا لدى المرضى، مما قد يؤثر على فعالية العلاج المناعي للسرطان. وللتغلب على هذه المشكلة، قد يُظهر استخدام تقنية CRISPR/Cas9 لإزالة مستقبلات الخلايا التائية بيتا الذاتية من الخلايا المتلقية، ثم نقل خلايا تائية تحمل مستقبلات الخلايا التائية بيتا إلى مرضى السرطان، استجابات مناعية أفضل مضادة للسرطان دون الحاجة إلى التنافس الجنسي لمستقبلات الخلايا التائية الذاتية (Fan et al. 2018). وبالتالي، باستثناء الخلايا التائية المعدلة بتقنية CRISPR، فإن مستقبلات الخلايا التائية أكثر حساسية لمستضدات الورم بألف مرة من الخلايا التائية الطبيعية المحولة بمستقبلات الخلايا التائية. بالإضافة إلى ذلك، في أنواع مختلفة من سرطان الدم، تُظهر الخلايا التائية المُعدَّلة المُنتَجة بتقنية كريسبر/كاس9 (γδ TCR+ CRISPR) تعبيرًا أعلى عن الخلايا التائية CD4+ وCD8+ مقارنةً بنقل مستقبلات الخلايا التائية القياسي (ليغوت وآخرون، 2018). لذا، قد تُشكِّل الخلايا التائية المُعدَّلة المُنتَجة بتقنية كريسبر/كاس9 طريقة علاج مناعي فعّالة للتغلب على سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
الإنتغرينات جزيئات التصاق خلوية موجودة في الأغشية الخلوية، وتُعزز ارتباط الخلايا بالمادة خارج الخلوية (Hamidi and Ivaska, 2018). يرتبط خلل تنظيم الإنتغرينات بتطور السرطان وانتشاره من خلال تغيير المادة خارج الخلوية، مما يؤدي إلى بقاء الخلايا السرطانية في الدورة الدموية (Hamidi and Ivaska, 2018). يُبطئ تثبيط الإنتغرينات باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 من تطور الورم وانتشاره واستعماره في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. وقد أُفيد أن تثبيط الإنتغرين ألفا 5 (ITGA5) يُقلل من هجرة الخلايا وتطورها في أنواع أخرى من السرطان، مثل سرطان الرئة (Ju et al., 2017)، مما يُشير إلى أن الإنتغرين ألفا 5 قد يكون أيضًا عاملًا رئيسيًا في نشأة سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
يُعدّ إنتاج فئران مُعدّلة جينيًا باستخدام طرق الخلايا الجذعية الجنينية التقليدية عمليةً شاقةً ومُستهلكةً للوقت وغير فعّالة. إذ تستغرق شهورًا وسنوات لاستهداف الخلايا الجذعية الجنينية من خلال إعادة التركيب المتماثل، ثمّ تربية فئران مُهجّنة، ومن ثمّ تهجينها مع فئران غير متجانسة لإنتاج ذرية متجانسة. ويتطلّب إنتاج فئران ذات طفرات جينية متعددة تهجينًا مُعقّدًا. مع ذلك، ظهرت العديد من المشاكل عند استخدام فئران مُنتجة عن طريق استئصال الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 أو عن طريق الحقن المجهري لمكونات CRISPR/Cas9 في بويضات مُخصّبة أحادية الخلية. على سبيل المثال، غالبًا ما يحدث إدخال التغييرات في مواقع ثنائية الأليلات ولا يكون خاصًا بجين مُحدّد. وقد أُفيد مؤخرًا أن الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 يُمكنها إدخال طفرات ثنائية الأليلات في ما يصل إلى 5 جينات في وقت واحد (نيشيزونو وآخرون، 2021). ولتحقيق هذا الغرض، تمّ نقل mRNA الخاص بـ Cas9 وخمسة gRNAs خاصة بجينات مُحدّدة إلى الخلايا الجذعية الجنينية في وقت واحد. يُبرز هذا مدى جدوى وفعالية هذا الإجراء، على الرغم من احتمال انتقال هذه الطفرات عند تهجين السلالات المؤسسة لإنتاج فئران مُعدّلة وراثيًا بخمسة جينات. كما تُشير الدراسة إلى اكتشاف مُفاجئ: لم تعد الخلايا الجذعية الجنينية ضرورية لإنتاج فئران مُعدّلة وراثيًا. فبدلًا من ذلك، ولإزالة منتجات جينية مُحددة، تم حقن mRNA وgRNA الخاصين بـ Cas9 في أجنة في مرحلة الخلية الواحدة. ونتيجةً لذلك، تم إنشاء سلالات مؤسسة مُعدّلة وراثيًا يُمكن استخدامها نظريًا لدراسة عواقب حذف الجينات في الفئران (Qin et al., 2016). وبالتالي، تُتيح تقنية CRISPR/Cas9 إنتاج فئران مُعدّلة وراثيًا لعلاج سرطان الثدي الثلاثي السلبي بتكلفة أقل من الهندسة الوراثية التقليدية. وباستخدام نظام CRISPR/Cas، تم تطوير نموذج جديد لفأر مُعدّل وراثيًا يُمكنه إدخال طفرات نقطية بنجاح في جين واحد أو أكثر من الجينات الداخلية في سرطان الثدي الثلاثي السلبي. وبناءً على هذا المفهوم، يمكن أيضًا تطوير نماذج حيوانية لسرطان الثدي الثلاثي السلبي باستخدام حذف BRCA1 وp53 بوساطة CRISPR/Cas9، مما يؤدي إلى فقدان إصلاح HR وعدم استقرار الجينوم والأنماط الظاهرية الطافرة (Annunziato et al.، 2020).
تُستخدم حاليًا طرقٌ مختلفة لتشخيص سرطان الثدي الثلاثي السلبي، مثل التصوير الشعاعي للثدي (الماموغرافي)، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، والموجات فوق الصوتية. إلا أن هذه الطرق لها بعض القيود. فالتصوير الشعاعي للثدي يُستخدم لتشخيص أنسجة الثدي الموضعية فقط، وليس النقائل السرطانية التي انتقلت إلى أعضاء أخرى. أما التصوير بالموجات فوق الصوتية، فهو ليس طريقةً موثوقةً لتشخيص هذا النوع من السرطان (Chen and Lee-Felker, 2023). يتميز التصوير بالرنين المغناطيسي بحساسية أعلى من الموجات فوق الصوتية والتصوير الشعاعي للثدي، لكن دقته التشخيصية محدودة (Sha and Chen, 2022). تُعد خزعة الأنسجة إجراءً جراحيًا لتحديد الخلايا السرطانية، ولكن في بعض الحالات، قد لا تُصيب الخزعة الأنسجة السرطانية إذا انحرفت الإبرة عن المنطقة المستهدفة. إضافةً إلى ذلك، فهي مكلفة للغاية وقد تكون مؤلمة للمريضة. ونظرًا لأن سرطان الثدي الثلاثي السلبي نوعٌ غير متجانس من السرطان، فقد لا تُوفر الخزعة معلوماتٍ كافيةً عن نوع السرطان. لذلك، ثمة حاجةٌ ماسةٌ إلى طريقةٍ تشخيصيةٍ جديدةٍ وموثوقةٍ للكشف عن هذا النوع من السرطان. قد تُشكّل تقنية CRISPR/Cas9 بديلاً عالي الحساسية وقليل التوغل لتشخيص سرطان الثدي. ولتحقيق هذه الغاية، يُمكن استخدام استراتيجيات تعتمد على CRISPR/Cas9 لتحسين طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتشخيص سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC). في البداية، يُستخدم بروتينا Cas9 وcpf1 في نظام CRISPR لإزالة الحمض النووي غير المُحدد، ثم يتعرف هذان البروتينان (Cas9 وcpf1) على تسلسل PAM قبل الارتباط بالحمض النووي المستهدف (ديباك سينغ وآخرون، 2021). وبالتالي، يُمكن لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تحديد الطفرات المرتبطة بتطور السرطان. وقد اعتمدت العديد من الدراسات هذه الاستراتيجية القائمة على CRISPR للكشف عن طفرات مختلفة في أنواع مختلفة من السرطان (سفاري وآخرون، 2019). لذا، قد تُقلل طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) القائمة على CRISPR من اعتماد تشخيص سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) على الطرق الجراحية، مثل الفحص المناعي النسيجي المعتمد على الخزعة.
تم إثبات وجود تغيرات جينية في تنظيم مستقبلات الهرمونات في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Chen and Russo, 2009). ويمكن لاستراتيجيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) القائمة على تقنية CRISPR/Cas9 باستخدام المصفوفات الدقيقة للتشخيص السريع رصد هذه الطفرات بفعالية (Hajian et al., 2019). كما يمكنها تزويد مقدمي الرعاية الصحية بمعلومات مهمة حول طفرات محددة لدى مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي، مما قد يُسهم في تحسين مسار علاجهم. مع ذلك، فإن هذه التقنية المُدمجة لها بعض القيود. لذا، يلزم بذل جهود بحثية مكثفة قبل استخدام طريقة CRISPR/Cas-PCR في الرعاية الصحية لتشخيص سرطان الثدي الثلاثي السلبي (Yang et al., 2019).