الأيضات التي تميز العقيدات الرئوية الحميدة والخبيثة بخصوصية عالية باستخدام التحليل الطيفي الشامل عالي الدقة لمصل المريض.

لا يزال التشخيص التفريقي للعقيدات الرئوية التي تم تحديدها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب يشكل تحديا في الممارسة السريرية.هنا، نقوم بوصف الأيض العالمي لـ 480 عينة مصل، بما في ذلك الضوابط الصحية، وعقيدات الرئة الحميدة، والمرحلة الأولى من سرطان الرئة الغدي.تظهر الأورام السرطانية الغدية ملامح استقلابية فريدة من نوعها، في حين أن العقيدات الحميدة والأفراد الأصحاء لديهم تشابه كبير في الملامح الأيضية.في مجموعة الاكتشاف (ن = 306)، تم تحديد مجموعة من 27 مستقلبًا للتمييز بين العقيدات الحميدة والخبيثة.كانت AUC للنموذج التمييزي في مجموعات التحقق الداخلي (ن = 104) والتحقق الخارجي (ن = 111) 0.915 و0.945 على التوالي.كشف تحليل المسار عن زيادة مستقلبات تحلل السكر المرتبطة بانخفاض التربتوفان في مصل سرطان الرئة الغدي مقارنة بالعقيدات الحميدة والضوابط الصحية، واقترح أن امتصاص التربتوفان يعزز تحلل السكر في خلايا سرطان الرئة.تسلط دراستنا الضوء على قيمة المؤشرات الحيوية لمستقلبات المصل في تقييم خطر العقيدات الرئوية المكتشفة بواسطة التصوير المقطعي.
التشخيص المبكر أمر بالغ الأهمية لتحسين معدلات البقاء على قيد الحياة لمرضى السرطان.أظهرت نتائج التجربة الوطنية الأمريكية لفحص سرطان الرئة (NLST) ودراسة نيلسون الأوروبية أن الفحص باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة (LDCT) يمكن أن يقلل بشكل كبير من وفيات سرطان الرئة في المجموعات المعرضة للخطر1،2،3.منذ الاستخدام الواسع النطاق لـ LDCT لتحري سرطان الرئة، استمر حدوث النتائج الشعاعية العرضية للعقيدات الرئوية عديمة الأعراض في الزيادة 4 .يتم تعريف العقيدات الرئوية على أنها عتامة بؤرية يصل قطرها إلى 3 سم 5 .نحن نواجه صعوبات في تقييم احتمالية الإصابة بالأورام الخبيثة والتعامل مع العدد الكبير من العقيدات الرئوية التي تم اكتشافها بالصدفة في LDCT.يمكن أن تؤدي القيود المفروضة على التصوير المقطعي المحوسب إلى فحوصات متابعة متكررة ونتائج إيجابية كاذبة، مما يؤدي إلى تدخل غير ضروري وإفراط في العلاج 6.ولذلك، هناك حاجة لتطوير مؤشرات حيوية موثوقة ومفيدة لتحديد سرطان الرئة بشكل صحيح في المراحل المبكرة والتمييز بين معظم العقيدات الحميدة عند الكشف الأولي 7 .
أدى التحليل الجزيئي الشامل للدم (المصل، البلازما، خلايا الدم وحيدة النواة المحيطية)، بما في ذلك علم الجينوم أو البروتينات أو مثيلة الحمض النووي 8،9،10، إلى اهتمام متزايد باكتشاف المؤشرات الحيوية التشخيصية لسرطان الرئة.وفي الوقت نفسه، تقيس مناهج التمثيل الغذائي المنتجات النهائية الخلوية التي تتأثر بالإجراءات الداخلية والخارجية، وبالتالي يتم تطبيقها للتنبؤ ببداية المرض ونتائجه.يعد قياس الطيف الكتلي السائل جنبًا إلى جنب (LC-MS) طريقة مستخدمة على نطاق واسع لدراسات التمثيل الغذائي نظرًا لحساسيته العالية ونطاقه الديناميكي الكبير، والذي يمكن أن يغطي المستقلبات ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة.على الرغم من استخدام التحليل الأيضي العالمي للبلازما/المصل لتحديد المؤشرات الحيوية المرتبطة بتشخيص سرطان الرئة وفعالية العلاج، إلا أن مصنفات مستقلبات المصل للتمييز بين عقيدات الرئة الحميدة والخبيثة لا تزال بحاجة إلى دراسة كثيرة.-أبحاث ضخمة.
السرطان الغدي وسرطان الخلايا الحرشفية هما النوعان الرئيسيان لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC).تشير اختبارات الفحص المقطعي المختلفة إلى أن السرطان الغدي هو النوع النسيجي الأكثر شيوعًا لسرطان الرئة.في هذه الدراسة، استخدمنا قياس الطيف الكتلي السائل عالي الدقة عالي الدقة (UPLC-HRMS) لإجراء تحليل التمثيل الغذائي على إجمالي 695 عينة مصل، بما في ذلك الضوابط الصحية، والعقيدات الرئوية الحميدة، والتصوير المقطعي المحوسب ≥3 سم.فحص المرحلة الأولى من سرطان الرئة الغدي.لقد حددنا مجموعة من مستقلبات المصل التي تميز سرطان الرئة الغدي عن العقيدات الحميدة والضوابط الصحية.كشف تحليل مسار التخصيب أن استقلاب التربتوفان والجلوكوز غير الطبيعي يعدان تغيرات شائعة في سرطان الغدة الرئوية مقارنة بالعقيدات الحميدة والضوابط الصحية.أخيرًا، أنشأنا مصنفًا استقلابيًا في الدم وتحققنا من صحته بخصوصية وحساسية عالية للتمييز بين العقيدات الرئوية الخبيثة والحميدة التي اكتشفها LDCT، مما قد يساعد في التشخيص التفريقي المبكر وتقييم المخاطر.
في الدراسة الحالية، تم جمع عينات المصل المتطابقة مع الجنس والعمر بأثر رجعي من 174 شخصًا صحيًا، و292 مريضًا يعانون من عقيدات رئوية حميدة، و229 مريضًا يعانون من سرطان الرئة الغدي في المرحلة الأولى.يتم عرض الخصائص الديموغرافية للمواضيع البالغ عددها 695 في الجدول التكميلي 1.
كما هو مبين في الشكل 1 أ، تم جمع ما مجموعه 480 عينة مصل، بما في ذلك 174 عينة مراقبة صحية (HC)، و 170 عقيدات حميدة (BN)، و 136 عينة من سرطان الرئة الغدي (LA) في المرحلة الأولى، في مركز السرطان بجامعة صن يات صن.مجموعة ديسكفري للتوصيف الأيضي غير المستهدف باستخدام التحليل اللوني السائل فائق الأداء - قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (UPLC-HRMS).كما هو مبين في الشكل التكميلي 1، تم تحديد المستقلبات التفاضلية بين LA وHC وLA وBN لإنشاء نموذج تصنيف ومواصلة استكشاف تحليل المسار التفاضلي.خضعت 104 عينة جمعها مركز السرطان بجامعة صن يات صن و111 عينة جمعها مستشفيان آخران للتحقق الداخلي والخارجي على التوالي.
مجتمع الدراسة في مجموعة الاكتشاف التي خضعت لتحليل استقلاب المصل العالمي باستخدام التحليل اللوني السائل عالي الأداء ومطياف الكتلة عالي الدقة (UPLC-HRMS).ب التحليل الجزئي لتمييز المربعات الصغرى (PLS-DA) للأيض الكلي لـ 480 عينة مصل من مجموعة الدراسة، بما في ذلك الضوابط الصحية (HC، n = 174)، والعقيدات الحميدة (BN، n = 170)، والمرحلة الأولى من سرطان الرئة الغدي (لوس أنجلوس، ن = 136).+ESI، وضع التأين بالرش الكهربائي الإيجابي، -ESI، وضع التأين بالرذاذ الكهربائي السلبي.c – e المستقلبات ذات الوفرة المختلفة بشكل كبير في مجموعتين محددتين (اختبار رتبة موقعة ويلكوكسون ثنائي الذيل، القيمة p المعدلة لمعدل الاكتشاف الخاطئ، FDR <0.05) تظهر باللون الأحمر (تغير الطية > 1.2) والأزرق (تغير الطية <0.83) .) يظهر على رسم البركان.f خريطة حرارة عنقودية هرمية توضح اختلافات كبيرة في عدد المستقلبات المشروحة بين LA و BN.يتم توفير البيانات المصدر في شكل ملفات بيانات المصدر.
تم تحليل إجمالي استقلاب المصل البالغ 174 HC و170 BN و136 LA في مجموعة الاكتشاف باستخدام تحليل UPLC-HRMS.نوضح أولاً أن عينات مراقبة الجودة (QC) تتجمع بإحكام في مركز نموذج تحليل المكونات الرئيسية غير الخاضع للرقابة (PCA)، مما يؤكد استقرار أداء الدراسة الحالية (الشكل التكميلي 2).
كما هو موضح في التحليل الجزئي لتمييز المربعات الصغرى (PLS-DA) في الشكل 1 ب، وجدنا أن هناك اختلافات واضحة بين LA وBN وLA وHC في أوضاع التأين بالرش الكهربائي الموجب (+ESI) والسالب (−ESI) .معزول.ومع ذلك، لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين BN وHC في ظروف +ESI و-ESI.
لقد وجدنا 382 ميزة تفاضلية بين LA وHC، و231 ميزة تفاضلية بين LA وBN، و95 ميزة تفاضلية بين BN وHC (اختبار تصنيف موقع ويلكوكسون، FDR <0.05 والتغيير المتعدد> 1.2 أو <0.83) (الشكل .1c-e) )..تمت إضافة تعليقات توضيحية إلى القمم (البيانات التكميلية 3) مقابل قاعدة بيانات (مكتبة mzCloud/HMDB/Chemspider) بقيمة m/z ووقت الاستبقاء والبحث عن الطيف الكتلي المجزأ (التفاصيل الموضحة في قسم الطرق) 22.أخيرًا ، تم تحديد 33 و 38 مستقلبًا مشروحًا مع اختلافات كبيرة في الوفرة لـ LA مقابل BN (الشكل 1f والجدول التكميلي 2) و LA مقابل HC (الشكل التكميلي 3 والجدول التكميلي 2) ، على التوالي.في المقابل، تم تحديد 3 مستقلبات فقط مع اختلافات كبيرة في الوفرة في BN وHC (الجدول التكميلي 2)، بما يتوافق مع التداخل بين BN وHC في PLS-DA.تغطي هذه المستقلبات التفاضلية مجموعة واسعة من المواد الكيميائية الحيوية (الشكل التكميلي 4).مجتمعة، تظهر هذه النتائج تغيرات كبيرة في استقلاب المصل والتي تعكس التحول الخبيث لسرطان الرئة في مرحلة مبكرة مقارنة مع عقيدات الرئة الحميدة أو الأشخاص الأصحاء.وفي الوقت نفسه، يشير التشابه في استقلاب المصل لـ BN وHC إلى أن العقيدات الرئوية الحميدة قد تشترك في العديد من الخصائص البيولوجية مع الأفراد الأصحاء.بالنظر إلى أن الطفرات الجينية لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) شائعة في النوع الفرعي 23 من سرطان الرئة الغدي، فقد سعينا إلى تحديد تأثير الطفرات المحركة على استقلاب المصل.قمنا بعد ذلك بتحليل الملف الأيضي العام لـ 72 حالة مع حالة EGFR في مجموعة سرطان الرئة الغدي.ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا ملفات تعريف قابلة للمقارنة بين مرضى متحولة EGFR (ن = 41) ومرضى النوع البري EGFR (ن = 31) في تحليل PCA (الشكل التكميلي 5 أ).ومع ذلك ، حددنا 7 مستقلبات تم تغيير وفرتها بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من طفرة EGFR مقارنة بالمرضى الذين يعانون من EGFR من النوع البري (اختبار t ، p <0.05 وتغير الطية> 1.2 أو <0.83) (الشكل التكميلي 5 ب).غالبية هذه المستقلبات (5 من 7) هي أسيل كارنيتينات، والتي تلعب دورًا مهمًا في مسارات أكسدة الأحماض الدهنية.
كما هو موضح في سير العمل الموضح في الشكل 2 أ، تم الحصول على المؤشرات الحيوية لتصنيف العقيدات باستخدام أقل عوامل الانكماش المطلق والاختيار بناءً على 33 مستقلبًا تفاضليًا تم تحديدها في LA (ن = 136) وBN (ن = 170).أفضل مجموعة من المتغيرات (LASSO) – نموذج الانحدار اللوجستي الثنائي.تم استخدام التحقق المتبادل بعشرة أضعاف لاختبار موثوقية النموذج.يتم ضبط الاختيار المتغير وتنظيم المعلمة من خلال عقوبة تعظيم الاحتمالية مع المعلمة 24.تم إجراء تحليل الأيض العالمي بشكل مستقل في مجموعات التحقق الداخلي (ن = 104) والتحقق الخارجي (ن = 111) لاختبار أداء التصنيف للنموذج التمييزي.نتيجة لذلك ، تم تحديد 27 مستقلبًا في مجموعة الاكتشاف كأفضل نموذج تمييزي مع أكبر قيمة متوسطة لـ AUC (الشكل 2 ب) ، من بينها 9 زاد نشاطها و 18 انخفض نشاطها في LA مقارنةً بـ BN (الشكل 2 ج).
سير العمل لبناء مصنف العقيدات الرئوية، بما في ذلك اختيار أفضل لوحة من مستقلبات المصل في مجموعة الاكتشاف باستخدام نموذج الانحدار اللوجستي الثنائي عبر التحقق المتبادل بعشرة أضعاف وتقييم الأداء التنبؤي في مجموعات التحقق الداخلية والخارجية.(ب) إحصائيات التحقق من الصحة لنموذج الانحدار LASSO لاختيار العلامات الحيوية الأيضية.تمثل الأرقام الواردة أعلاه متوسط ​​عدد المؤشرات الحيوية المحددة عند α معين.يمثل الخط المنقط الأحمر متوسط ​​قيمة AUC عند لامدا المقابلة.تمثل أشرطة الخطأ الرمادية الحد الأدنى والحد الأقصى لقيم AUC.يشير الخط المنقط إلى أفضل نموذج يحتوي على 27 علامة حيوية مختارة.AUC، المنطقة الواقعة أسفل منحنى خاصية تشغيل المستقبِل (ROC).ج أضعاف التغييرات في 27 مستقلبًا محددًا في مجموعة LA مقارنة بمجموعة BN في مجموعة الاكتشاف.العمود الأحمر – التنشيط.العمود الأزرق هو انخفاض.d - f منحنيات خاصية تشغيل المستقبِل (ROC) توضح قوة النموذج المميز استنادًا إلى 27 مجموعة مستقلبة في مجموعات التحقق من الصحة الداخلية والخارجية.يتم توفير البيانات المصدر في شكل ملفات بيانات المصدر.
تم إنشاء نموذج تنبؤ بناءً على معاملات الانحدار المرجحة لهذه المستقلبات الـ 27 (الجدول التكميلي 3).أسفر تحليل ROC بناءً على هذه المستقلبات الـ 27 عن مساحة تحت المنحنى (AUC) بقيمة 0.933، وكانت حساسية مجموعة الاكتشاف 0.868، وكانت الخصوصية 0.859 (الشكل 2 د).وفي الوقت نفسه، من بين المستقلبات التفاضلية المشروحة البالغ عددها 38 بين LA وHC، حققت مجموعة من 16 مستقلبًا AUC بقيمة 0.902 مع حساسية 0.801 وخصوصية 0.856 في تمييز LA عن HC (الشكل التكميلي 6 أ-ج).وتمت أيضًا مقارنة قيم AUC بناءً على عتبات تغيير الطيات المختلفة للأيضات التفاضلية.لقد وجدنا أن نموذج التصنيف كان أفضل أداء في التمييز بين LA وBN (HC) عندما تم ضبط مستوى تغيير الطية على 1.2 مقابل 1.5 أو 2.0 (الشكل التكميلي 7 أ، ب).تم التحقق من صحة نموذج التصنيف، الذي يعتمد على 27 مجموعة مستقلبة، بشكل أكبر في الأفواج الداخلية والخارجية.كانت AUC 0.915 (حساسية 0.867، خصوصية 0.811) للتحقق الداخلي و 0.945 (حساسية 0.810، خصوصية 0.979) للتحقق الخارجي (الشكل 2 هـ، و).لتقييم الكفاءة بين المختبرات، تم تحليل 40 عينة من المجموعة الخارجية في مختبر خارجي كما هو موضح في قسم الطرق.حققت دقة التصنيف AUC بقيمة 0.925 (الشكل التكميلي 8).نظرًا لأن سرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC) هو النوع الفرعي الثاني الأكثر شيوعًا لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) بعد سرطان الرئة الغدي (LUAD)، فقد قمنا أيضًا باختبار الفائدة المحتملة المتحققة من الملامح الأيضية.BN و 16 حالة LUSC.كانت AUC للتمييز بين LUSC وBN 0.776 (الشكل التكميلي 9)، مما يشير إلى قدرة أضعف مقارنة بالتمييز بين LUAD وBN.
أظهرت الدراسات أن حجم العقيدات في الصور المقطعية يرتبط بشكل إيجابي باحتمالية الإصابة بالأورام الخبيثة ويظل محددًا رئيسيًا لعلاج العقيدات.أظهر تحليل البيانات من مجموعة كبيرة من دراسة فحص NELSON أن خطر الإصابة بالأورام الخبيثة في الأشخاص الذين لديهم عقد أقل من 5 مم كان مشابهًا لذلك في الأشخاص الذين ليس لديهم عقد 28.ولذلك، فإن الحد الأدنى للحجم الذي يتطلب مراقبة منتظمة للأشعة المقطعية هو 5 ملم، على النحو الموصى به من قبل جمعية أمراض الصدر البريطانية (BTS)، و 6 ملم، على النحو الموصى به من قبل جمعية فليشنر 29 .ومع ذلك، فإن العقيدات التي يزيد حجمها عن 6 مم وبدون سمات حميدة واضحة، تسمى العقيدات الرئوية غير المحددة (IPN)، تظل تحديًا كبيرًا في التقييم والإدارة في الممارسة السريرية .درسنا بعد ذلك ما إذا كان حجم العقيدات يؤثر على التوقيعات الأيضية باستخدام عينات مجمعة من مجموعات الاكتشاف والتحقق الداخلي.من خلال التركيز على 27 علامة حيوية تم التحقق من صحتها، قمنا أولاً بمقارنة ملفات تعريف PCA الخاصة باستقلابات HC وBN تحت 6 مم.لقد وجدنا أن معظم نقاط البيانات الخاصة بـ HC وBN متداخلة، مما يدل على أن مستويات مستقلبات المصل كانت متشابهة في كلا المجموعتين (الشكل 3 أ).ظلت خرائط الميزات عبر نطاقات أحجام مختلفة محفوظة في BN و LA (الشكل 3 ب، ج) ، في حين لوحظ وجود فصل بين العقيدات الخبيثة والحميدة في نطاق 6-20 ملم (الشكل ثلاثي الأبعاد).كان لدى هذا الفوج AUC قدره 0.927، ونوعية 0.868، وحساسية 0.820 للتنبؤ بالأورام الخبيثة في العقيدات التي يتراوح حجمها من 6 إلى 20 مم (الشكل 3 هـ، و).تظهر نتائجنا أن المصنف يمكنه التقاط التغيرات الأيضية الناجمة عن التحول الخبيث المبكر، بغض النظر عن حجم العقيدات.
مقارنة ملفات تعريف PCA بين مجموعات محددة بناءً على مصنف أيضي مكون من 27 مستقلبًا.CC وBN <6 ملم.ب BN <6 مم مقابل BN 6–20 مم.في LA 6-20 ملم مقابل LA 20-30 ملم.ز BN 6-20 ملم و LA 6-20 ملم.جي سي، ن = 174؛BN < 6 مم، ن = 153؛BN 6-20 مم، ن = 91؛لا 6-20 ملم، ن = 89؛LA 20–30 مم، n = 77. e يُظهر منحنى خاصية تشغيل المستقبل (ROC) أداء النموذج المميز للعقيدات 6-20 مم.و حُسبت القيم الاحتمالية بناءً على نموذج الانحدار اللوجستي للعقيدات التي يتراوح حجمها بين 6 و20 ملم.يمثل الخط المنقط الرمادي قيمة القطع المثالية (0.455).تمثل الأرقام أعلاه النسبة المئوية للحالات المتوقعة في لوس أنجلوس.استخدم اختبار الطالب ثنائي الذيل.يعنيPCA تحليل المكون الرئيسي.منطقة AUC تحت المنحنى.يتم توفير البيانات المصدر في شكل ملفات بيانات المصدر.
تم اختيار أربع عينات (تتراوح أعمارهم بين 44-61 عامًا) بأحجام عقيدات رئوية مماثلة (7-9 مم) لتوضيح أداء نموذج التنبؤ بالأورام الخبيثة المقترح (الشكل 4 أ، ب).في الفحص الأولي، تم تقديم الحالة 1 كعقيدة صلبة مع تكلس، وهي ميزة مرتبطة بالحميدة، في حين تم تقديم الحالة 2 كعقيدة صلبة جزئيًا غير محددة مع عدم وجود ميزات حميدة واضحة.أظهرت ثلاث جولات من الأشعة المقطعية للمتابعة أن هذه الحالات ظلت مستقرة على مدى فترة 4 سنوات، وبالتالي اعتبرت عقيدات حميدة (الشكل 4 أ).بالمقارنة مع التقييم السريري لفحوصات الأشعة المقطعية التسلسلية، حدد تحليل مستقلب المصل أحادي الطلقة باستخدام نموذج المصنف الحالي هذه العقيدات الحميدة بسرعة وبشكل صحيح بناءً على القيود الاحتمالية (الجدول 1).يُظهر الشكل 4 ب في الحالة 3 عقيدة مع علامات التراجع الجنبي، والتي ترتبط غالبًا بالأورام الخبيثة .تم تقديم الحالة 4 على أنها عقيدات صلبة جزئيًا غير محددة مع عدم وجود دليل على وجود سبب حميد.تم التنبؤ بجميع هذه الحالات على أنها خبيثة وفقًا لنموذج المصنف (الجدول 1).تم إثبات تقييم سرطان الغدة الرئوية من خلال الفحص النسيجي المرضي بعد جراحة استئصال الرئة (الشكل 4 ب).بالنسبة لمجموعة التحقق الخارجي، تنبأ المصنف الأيضي بدقة بحالتين من عقيدات الرئة غير المحددة أكبر من 6 مم (الشكل التكميلي 10).
صور مقطعية للنافذة المحورية للرئتين لحالتين من العقيدات الحميدة.في الحالة 1، أظهر التصوير المقطعي بعد 4 سنوات وجود عقيدة صلبة مستقرة بقياس 7 ملم مع تكلس في الفص السفلي الأيمن.في الحالة 2، كشف التصوير المقطعي بعد 5 سنوات عن وجود عقيدة مستقرة وصلبة جزئيًا يبلغ قطرها 7 ملم في الفص العلوي الأيمن.(ب) الصور المقطعية المحورية للنافذة للرئتين والدراسات المرضية المقابلة لحالتين من المرحلة الأولى من سرطان الغدة قبل استئصال الرئة.كشفت الحالة 3 عن وجود عقيدة يبلغ قطرها 8 ملم في الفص العلوي الأيمن مع تراجع جنبي.كشفت الحالة 4 عن وجود عقيدات زجاجية أرضية صلبة جزئيًا بقياس 9 ملم في الفص العلوي الأيسر.تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوسين (H&E) لأنسجة الرئة المقطوعة (شريط المقياس = 50 ميكرومتر) مما يدل على نمط نمو عنيبية لسرطان الرئة الغدي.تشير الأسهم إلى العقيدات المكتشفة في الصور المقطعية.صور H&E هي صور تمثيلية لحقول مجهرية متعددة (> 3) تم فحصها بواسطة أخصائي علم الأمراض.
مجتمعة، تظهر نتائجنا القيمة المحتملة للمؤشرات الحيوية المستقلبة في المصل في التشخيص التفريقي للعقيدات الرئوية، والتي قد تشكل تحديات عند تقييم الفحص بالأشعة المقطعية.
استنادًا إلى لوحة المستقلبات التفاضلية المعتمدة، سعينا إلى تحديد الارتباطات البيولوجية للتغيرات الأيضية الرئيسية.حدد تحليل إثراء مسار KEGG بواسطة MetaboAnalyst 6 مسارات شائعة تم تغييرها بشكل كبير بين المجموعتين المحددتين (LA مقابل HC وLA مقابل BN، المعدل p ≥ 0.001، التأثير> 0.01).تميزت هذه التغييرات باضطرابات في استقلاب البيروفات، واستقلاب التربتوفان، واستقلاب النياسين والنيكوتيناميد، وتحلل السكر، ودورة TCA، واستقلاب البيورين (الشكل 5 أ).قمنا بعد ذلك بإجراء عمليات التمثيل الغذائي المستهدفة للتحقق من التغييرات الرئيسية باستخدام القياس الكمي المطلق.تحديد المستقلبات الشائعة في المسارات المتغيرة بشكل شائع عن طريق قياس الطيف الكتلي الثلاثي الرباعي (QQQ) باستخدام معايير المستقلبات الأصلية.يتم تضمين الخصائص الديموغرافية للعينة المستهدفة لدراسة التمثيل الغذائي في الجدول التكميلي 4. تمشيا مع نتائج التمثيل الغذائي العالمية لدينا ، أكد التحليل الكمي أن الهيبوكسانثين والزانثين والبيروفات واللاكتات قد زادت في LA مقارنة بـ BN و HC (الشكل 5 ب ، ج ، ف <0.05).ومع ذلك، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في هذه المستقلبات بين BN وHC.
تحليل تخصيب مسار KEGG للأيضات المختلفة بشكل كبير في مجموعة LA مقارنة بمجموعتي BN وHC.تم استخدام اختبار Globaltest ثنائي الذيل، وتم ضبط القيم p باستخدام طريقة Holm-Bonferroni (المعدل p ≥ 0.001 وحجم التأثير > 0.01).ب - د مؤامرات الكمان تظهر مستويات هيبوكسانثين، زانثين، لاكتات، بيروفيت، والتربتوفان في مصل HC، BN، وLA يحددها LC-MS / MS (ن = 70 لكل مجموعة).تشير الخطوط المنقطة باللونين الأبيض والأسود إلى الوسيط والربيع، على التوالي.مؤامرة الكمان تظهر تعبير Log2TPM الطبيعي (نصوص لكل مليون) mRNA لـ SLC7A5 و QPRT في سرطان الرئة الغدي (ن = 513) مقارنة بأنسجة الرئة الطبيعية (ن = 59) في مجموعة بيانات LUAD-TCGA.يمثل المربع الأبيض النطاق الربعي، ويمثل الخط الأسود الأفقي في المنتصف الوسيط، ويمثل الخط الأسود العمودي الممتد من الصندوق فاصل الثقة 95٪ (CI).f مؤامرة ارتباط بيرسون للتعبير SLC7A5 و GAPDH في سرطان الغدة الرئوية ( ن = 513) وأنسجة الرئة الطبيعية ( ن = 59) في مجموعة بيانات TCGA.تمثل المنطقة الرمادية 95% CI.ص ، معامل ارتباط بيرسون.g مستويات التربتوفان الخلوية الطبيعية في خلايا A549 المنقولة عن طريق التحكم غير المحدد في shRNA (NC) و shSLC7A5 (Sh1، Sh2) التي يحددها LC-MS / MS.يتم تقديم التحليل الإحصائي لخمس عينات مستقلة بيولوجيا في كل مجموعة.h المستويات الخلوية لـ NADt (إجمالي NAD، بما في ذلك NAD + و NADH) في خلايا A549 (NC) وخلايا SLC7A5 ضربة قاضية A549 (Sh1، Sh2).يتم تقديم التحليل الإحصائي لثلاث عينات مستقلة بيولوجيا في كل مجموعة.تم قياس نشاط تحلل السكر في خلايا A549 قبل وبعد ضربة قاضية SLC7A5 بواسطة معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) (ن = 4 عينات مستقلة بيولوجيًا لكل مجموعة).2-DG،2-ديوكسي-D-جلوكوز.تم استخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل في ( ب – ح ).في (g – i)، تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± SD، وتم إجراء كل تجربة ثلاث مرات بشكل مستقل وكانت النتائج متشابهة.يتم توفير البيانات المصدر في شكل ملفات بيانات المصدر.
بالنظر إلى التأثير الكبير لاستقلاب التربتوفان المتغير في مجموعة LA، قمنا أيضًا بتقييم مستويات التربتوفان في الدم في مجموعات HC وBN وLA باستخدام QQQ.لقد وجدنا أن تريبتوفان المصل انخفض في LA مقارنة بـ HC أو BN (P <0.001، الشكل 5 د)، وهو ما يتوافق مع النتائج السابقة التي تفيد بأن مستويات التربتوفان المنتشرة أقل في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة مقارنة بالضوابط الصحية من المجموعة الضابطة . ،35.وجدت دراسة أخرى باستخدام جهاز تتبع PET/CT 11C-ميثيل-L-تريبتوفان أن وقت الاحتفاظ بإشارة التربتوفان في أنسجة سرطان الرئة قد زاد بشكل ملحوظ مقارنة بالآفات الحميدة أو الأنسجة الطبيعية.نحن نفترض أن الانخفاض في التربتوفان في مصل LA قد يعكس امتصاص التربتوفان النشط بواسطة خلايا سرطان الرئة.
ومن المعروف أيضًا أن المنتج النهائي لمسار الكينورينين لتقويض التربتوفان هو NAD+37,38، وهو ركيزة مهمة لتفاعل جليسرالديهايد-3-فوسفات مع 1,3-بيسفوسفوجليسيرات في تحلل السكر.في حين ركزت الدراسات السابقة على دور تقويض التربتوفان في تنظيم المناعة، فقد سعينا إلى توضيح التفاعل بين خلل تنظيم التربتوفان ومسارات تحلل السكر التي لوحظت في الدراسة الحالية.من المعروف أن عائلة النقل المذاب 7 عضو 5 (SLC7A5) هي ناقلة التربتوفان .إن إنزيم فسفوريبوزيل ترانسفيراز حمض الكينولينيك (QPRT) هو إنزيم يقع أسفل مسار الكينورينين الذي يحول حمض الكينولينيك إلى NAMN46.كشف فحص مجموعة بيانات LUAD TCGA أن كلا من SLC7A5 و QPRT تم تنظيمهما بشكل كبير في أنسجة الورم مقارنة بالأنسجة الطبيعية (الشكل 5 هـ).وقد لوحظت هذه الزيادة في المرحلتين الأولى والثانية وكذلك المرحلتين الثالثة والرابعة من سرطان الرئة الغدي (الشكل التكميلي 11) ، مما يشير إلى الاضطرابات المبكرة في استقلاب التربتوفان المرتبطة بتكوين الأورام.
بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مجموعة بيانات LUAD-TCGA وجود علاقة إيجابية بين تعبير SLC7A5 وGAPDH mRNA في عينات مرضى السرطان (r = 0.45، p = 1.55E-26، الشكل 5f).في المقابل، لم يتم العثور على ارتباط كبير بين هذه التوقيعات الجينية في أنسجة الرئة الطبيعية (r = 0.25، p = 0.06، الشكل 5f).ضربة قاضية لـ SLC7A5 (الشكل التكميلي 12) في الخلايا A549 قللت بشكل كبير من مستويات التربتوفان الخلوي و NAD (H) (الشكل 5 ز، ح)، مما أدى إلى نشاط تحلل السكر الموهن مقاسًا بمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) (الشكل 1).5 ط).وبالتالي، استنادًا إلى التغيرات الأيضية في المصل وفي الكشف المختبري، نفترض أن استقلاب التربتوفان قد ينتج NAD + من خلال مسار الكينورينين ويلعب دورًا مهمًا في تعزيز تحلل السكر في سرطان الرئة.
أظهرت الدراسات أن عددًا كبيرًا من العقيدات الرئوية غير المحددة المكتشفة بواسطة LDCT قد يؤدي إلى الحاجة إلى اختبارات إضافية مثل PET-CT، وخزعة الرئة، والعلاج الزائد بسبب التشخيص الإيجابي الكاذب للورم الخبيث.31 كما هو مبين في الشكل 6، حددت دراستنا مجموعة من مستقلبات المصل ذات قيمة تشخيصية محتملة قد تعمل على تحسين التقسيم الطبقي للمخاطر والإدارة اللاحقة للعقيدات الرئوية المكتشفة بواسطة التصوير المقطعي.
يتم تقييم العقيدات الرئوية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة (LDCT) مع ميزات تصوير توحي بوجود أسباب حميدة أو خبيثة.يمكن أن تؤدي النتائج غير المؤكدة للعقيدات إلى زيارات متابعة متكررة وتدخلات غير ضرورية والإفراط في العلاج.قد يؤدي إدراج المصنفات الأيضية في الدم ذات القيمة التشخيصية إلى تحسين تقييم المخاطر والإدارة اللاحقة للعقيدات الرئوية.التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني PET.
تشير البيانات المستمدة من دراسة NLST الأمريكية ودراسة NELSON الأوروبية إلى أن فحص المجموعات المعرضة للخطر باستخدام جرعة منخفضة من التصوير المقطعي المحوسب (LDCT) قد يقلل من معدل الوفيات بسرطان الرئة 1،3.ومع ذلك، يظل تقييم المخاطر والإدارة السريرية اللاحقة لأعداد كبيرة من العقيدات الرئوية العرضية المكتشفة بواسطة LDCT هو الأكثر صعوبة.الهدف الرئيسي هو تحسين التصنيف الصحيح للبروتوكولات القائمة على LDCT من خلال دمج المؤشرات الحيوية الموثوقة.
تم تحديد بعض المؤشرات الحيوية الجزيئية، مثل مستقلبات الدم، من خلال مقارنة سرطان الرئة مع الضوابط الصحية.في الدراسة الحالية، ركزنا على تطبيق تحليل استقلاب المصل للتمييز بين العقيدات الرئوية الحميدة والخبيثة التي تم اكتشافها بالصدفة بواسطة LDCT.قمنا بمقارنة استقلاب المصل العالمي للتحكم الصحي (HC)، وعقيدات الرئة الحميدة (BN)، وعينات سرطان الرئة الغدي (LA) في المرحلة الأولى باستخدام تحليل UPLC-HRMS.لقد وجدنا أن HC وBN لهما ملامح استقلابية مماثلة، في حين أظهرت LA تغيرات كبيرة مقارنة بـ HC وBN.حددنا مجموعتين من مستقلبات المصل التي تميز LA عن HC وBN.
يعتمد مخطط التحديد الحالي القائم على LDCT للعقيدات الحميدة والخبيثة بشكل أساسي على حجم العقيدات وكثافتها وتشكلها ومعدل نموها بمرور الوقت.وقد أظهرت الدراسات السابقة أن حجم العقيدات يرتبط ارتباطًا وثيقًا باحتمالية الإصابة بسرطان الرئة.حتى في المرضى المعرضين لمخاطر عالية، يكون خطر الإصابة بالأورام الخبيثة في العقد التي يقل حجمها عن 6 ملم أقل من 1%.يتراوح خطر الإصابة بالأورام الخبيثة للعقيدات التي يتراوح حجمها من 6 إلى 20 ملم من 8٪ إلى 64٪30.ولذلك، توصي جمعية فليشنر بقطر قطع يبلغ 6 ملم للمتابعة الروتينية للأشعة المقطعية.29 ومع ذلك، لم يتم إجراء تقييم المخاطر وإدارة العقيدات الرئوية غير المحددة (IPN) الأكبر من 6 ملم بشكل كاف 31.تعتمد الإدارة الحالية لأمراض القلب الخلقية عادةً على الانتظار اليقظ مع المراقبة المتكررة للأشعة المقطعية.
استنادًا إلى التمثيل الغذائي الذي تم التحقق من صحته، أظهرنا لأول مرة تداخل التواقيع الأيضية بين الأفراد الأصحاء والعقيدات الحميدة <6 مم.يتوافق التشابه البيولوجي مع نتائج التصوير المقطعي السابقة التي تفيد بأن خطر الإصابة بالأورام الخبيثة للعقيدات <6 مم منخفض كما هو الحال بالنسبة للأشخاص الذين ليس لديهم عقد.30 تجدر الإشارة إلى أن نتائجنا توضح أيضًا أن العقيدات الحميدة <6 مم و ≥6 مم لديها مستويات عالية التشابه في الملامح الأيضية، مما يشير إلى أن التعريف الوظيفي للمسببات الحميدة ثابت بغض النظر عن حجم العقيدات.وبالتالي، قد توفر لوحات مستقلبات المصل التشخيصية الحديثة اختبارًا واحدًا كاختبار استبعاد عندما يتم اكتشاف العقيدات في البداية بالأشعة المقطعية وربما تقلل من المراقبة التسلسلية.في الوقت نفسه، ميزت نفس لوحة المؤشرات الحيوية الأيضية العقيدات الخبيثة التي يبلغ حجمها ≥6 مم عن العقيدات الحميدة وقدمت تنبؤات دقيقة لـ IPNs ذات الحجم المماثل والميزات المورفولوجية الغامضة على الصور المقطعية.كان أداء مصنف استقلاب المصل جيدًا في التنبؤ بالورم الخبيث للعقيدات ≥6 مم مع AUC قدره 0.927.مجتمعة، تشير نتائجنا إلى أن التوقيعات الأيضية الفريدة في المصل قد تعكس على وجه التحديد التغيرات الأيضية المبكرة الناجمة عن الورم ولها قيمة محتملة كمتنبئات للمخاطر، بغض النظر عن حجم العقيدات.
والجدير بالذكر أن سرطان الرئة الغدي (LUAD) وسرطان الخلايا الحرشفية (LUSC) هما النوعان الرئيسيان لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC).نظرًا لأن LUSC يرتبط بقوة باستخدام التبغ وأن LUAD هو الأنسجة الأكثر شيوعًا لعقيدات الرئة العرضية المكتشفة في فحص الأشعة المقطعية، فقد تم تصميم نموذج المصنف الخاص بنا خصيصًا لعينات سرطان الغدة في المرحلة الأولى.ركز وانج وزملاؤه أيضًا على LUAD، وحددوا تسعة بصمات دهنية باستخدام علم الدهون لتمييز سرطان الرئة في مرحلة مبكرة عن الأفراد الأصحاء.قمنا باختبار نموذج المصنف الحالي على 16 حالة من المرحلة الأولى LUSC و74 عقيدات حميدة ولاحظنا دقة تنبؤ منخفضة لـ LUSC (AUC 0.776)، مما يشير إلى أن LUAD وLUSC قد يكون لهما توقيعات استقلابية خاصة بهما.في الواقع، لقد ثبت أن LUAD وLUSC يختلفان في المسببات والأصل البيولوجي والانحرافات الجينية.ولذلك، ينبغي إدراج أنواع أخرى من الأنسجة في نماذج التدريب للكشف عن سرطان الرئة على أساس السكان في برامج الفحص.
هنا، حددنا المسارات الستة الأكثر تغيرًا في سرطان الرئة الغدي مقارنةً بالضوابط الصحية والعقيدات الحميدة.الزانثين والهيبوكسانثين هما مستقلبات شائعة في المسار الأيضي للبيورين.تمشيا مع نتائجنا، تم زيادة المواد الوسيطة المرتبطة باستقلاب البيورين بشكل ملحوظ في مصل أو أنسجة المرضى الذين يعانون من سرطان غدي الرئة مقارنة مع الضوابط الصحية أو المرضى في مرحلة ما قبل التوغل 15،50.قد تعكس مستويات الزانثين والهيبوكسانثين المرتفعة في المصل عملية البناء التي تتطلبها الخلايا السرطانية سريعة الانتشار.يعد خلل تنظيم استقلاب الجلوكوز سمة مميزة معروفة لاستقلاب السرطان .هنا، لاحظنا زيادة كبيرة في البيروفات واللاكتات في مجموعة LA مقارنة مع مجموعة HC وBN، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة عن تشوهات مسار تحلل السكر في ملامح استقلاب المصل لمرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) و ضوابط صحية.النتائج متسقة.
الأهم من ذلك أننا لاحظنا وجود علاقة عكسية بين استقلاب البيروفات والتربتوفان في مصل الأورام السرطانية الرئوية.تم تخفيض مستويات التربتوفان في الدم في مجموعة LA مقارنة بمجموعة HC أو BN.ومن المثير للاهتمام أن دراسة سابقة واسعة النطاق باستخدام أترابية محتملة وجدت أن المستويات المنخفضة من التربتوفان المنتشرة كانت مرتبطة بزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة 54.التربتوفان هو حمض أميني أساسي نحصل عليه بالكامل من الطعام.نستنتج أن استنزاف التربتوفان في المصل في سرطان الرئة الغدي قد يعكس الاستنزاف السريع لهذا المستقلب.من المعروف أن المنتج النهائي لتقويض التربتوفان عبر مسار الكينورينين هو مصدر تخليق دي نوفو NAD+.نظرًا لأن NAD + يتم إنتاجه بشكل أساسي من خلال مسار الإنقاذ، فإن أهمية NAD + في استقلاب التربتوفان في الصحة والمرض لا تزال بحاجة إلى تحديد.أظهر تحليلنا لقاعدة بيانات TCGA أن التعبير عن ناقل التربتوفان المذاب 7A5 (SLC7A5) زاد بشكل كبير في سرطان الغدة الرئوية مقارنة مع الضوابط الطبيعية وارتبط بشكل إيجابي مع التعبير عن إنزيم تحلل السكر GAPDH.ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على دور تقويض التربتوفان في قمع الاستجابة المناعية المضادة للورم .نوضح هنا أن تثبيط امتصاص التربتوفان عن طريق ضربة قاضية لـ SLC7A5 في خلايا سرطان الرئة يؤدي إلى انخفاض لاحق في مستويات NAD الخلوية وما يصاحب ذلك من توهين لنشاط تحلل السكر.باختصار، توفر دراستنا أساسًا بيولوجيًا للتغيرات في استقلاب المصل المرتبط بالتحول الخبيث لسرطان الرئة الغدي.
طفرات EGFR هي الطفرات المحركة الأكثر شيوعًا لدى مرضى NSCLC.في دراستنا، وجدنا أن المرضى الذين يعانون من طفرة EGFR (ن = 41) لديهم ملامح استقلابية عامة مماثلة للمرضى الذين يعانون من EGFR من النوع البري (ن = 31)، على الرغم من أننا وجدنا انخفاضًا في مستويات المصل لدى بعض مرضى طفرة EGFR في مرضى الأسيل كارنيتين.تتمثل الوظيفة الثابتة للأسيل كارنيتينات في نقل مجموعات الأسيل من السيتوبلازم إلى مصفوفة الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى أكسدة الأحماض الدهنية لإنتاج الطاقة 55 .تمشيًا مع النتائج التي توصلنا إليها، حددت دراسة حديثة أيضًا ملامح استقلابية مماثلة بين أورام EGFR المتحولة وأورام EGFR من النوع البري من خلال تحليل الأيض العالمي لـ 102 عينة من أنسجة سرطان الغدة الرئوية.ومن المثير للاهتمام أنه تم العثور أيضًا على محتوى الأسيل كارنيتين في مجموعة EGFR المتحولة.ولذلك، ما إذا كانت التغيرات في مستويات الأسيل كارنيتين تعكس التغيرات الأيضية التي يسببها EGFR والمسارات الجزيئية الأساسية قد تستحق المزيد من الدراسة.
في الختام، تحدد دراستنا مصنفًا استقلابيًا في الدم للتشخيص التفريقي للعقيدات الرئوية وتقترح سير عمل يمكنه تحسين تقييم المخاطر وتسهيل الإدارة السريرية بناءً على فحص التصوير المقطعي المحوسب.
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى السرطان بجامعة صن يات صن، والمستشفى الأول التابع لجامعة صن يات صن، ولجنة الأخلاقيات في مستشفى السرطان بجامعة تشنغتشو.في مجموعات الاكتشاف والتحقق الداخلي، تم جمع 174 مصلًا من أفراد أصحاء و244 مصلًا من عقيدات حميدة من أفراد يخضعون لفحوصات طبية سنوية في قسم مكافحة السرطان والوقاية منه، مركز السرطان بجامعة صن يات صن، و166 عقيدات حميدة.مصل.تم جمع الأورام الغدية الرئوية في المرحلة الأولى من مركز السرطان بجامعة صن يات صن.في مجموعة التحقق الخارجي، كان هناك 48 حالة من العقيدات الحميدة، و39 حالة من سرطان الرئة الغدي في المرحلة الأولى من المستشفى الأول التابع لجامعة صن يات صن، و24 حالة من سرطان الرئة الغدي في المرحلة الأولى من مستشفى تشنغتشو للسرطان.قام مركز السرطان بجامعة صن يات صن أيضًا بجمع 16 حالة من حالات سرطان الرئة ذو الخلايا الحرشفية في المرحلة الأولى لاختبار القدرة التشخيصية للمصنف الأيضي المحدد (تظهر خصائص المريض في الجدول التكميلي 5).تم جمع عينات من مجموعة الاكتشاف ومجموعة التحقق الداخلي في الفترة ما بين يناير 2018 ومايو 2020. وتم جمع عينات من مجموعة التحقق الخارجي في الفترة ما بين أغسطس 2021 وأكتوبر 2022. ولتقليل التحيز بين الجنسين، تم تخصيص أعداد متساوية تقريبًا من حالات الذكور والإناث لكل منهما. الفوج.فريق الاكتشاف وفريق المراجعة الداخلية.تم تحديد جنس المشارك بناءً على التقرير الذاتي.تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين ولم يتم تقديم أي تعويض.كان الأشخاص الذين لديهم عقيدات حميدة هم أولئك الذين لديهم درجة مستقرة في التصوير المقطعي لمدة تتراوح بين 2 إلى 5 سنوات في وقت التحليل، باستثناء حالة واحدة من عينة التحقق الخارجية، والتي تم جمعها قبل الجراحة وتشخيصها بواسطة التشريح المرضي.باستثناء التهاب الشعب الهوائية المزمن.تم جمع حالات سرطان الرئة الغدي قبل استئصال الرئة وتأكيدها عن طريق التشخيص المرضي.تم جمع عينات الدم الصائمة في أنابيب فصل المصل دون أي مضادات التخثر.تم تخثر عينات الدم لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة ثم تم طردها بالطرد المركزي عند 2851 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع طاف المصل.تم تجميد قسامات المصل عند -80 درجة مئوية حتى استخراج المستقلب.قام قسم الوقاية من السرطان والفحص الطبي بمركز السرطان بجامعة صن يات صن بجمع مجموعة من المصل من 100 متبرع سليم، بما في ذلك عدد متساو من الرجال والنساء الذين تتراوح أعمارهم بين 40 إلى 55 عامًا.تم خلط كميات متساوية من كل عينة من الجهات المانحة، وتم قسامة المجموعة الناتجة وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.تم استخدام خليط المصل كمواد مرجعية لمراقبة الجودة وتوحيد البيانات.
تمت إذابة المصل المرجعي وعينات الاختبار وتم استخلاص المستقلبات باستخدام طريقة الاستخلاص المجمعة (MTBE/ميثانول/ماء) 56.باختصار، تم خلط 50 ميكرولتر من المصل مع 225 ميكرولتر من الميثانول المثلج و750 ميكرولتر من ميثيل ثالثي بوتيل إيثر المثلج (MTBE).يقلب الخليط ويحتضن على الجليد لمدة 1 ساعة.تم بعد ذلك خلط العينات وخلط الدوامة مع 188 ميكرولتر من الماء بدرجة MS الذي يحتوي على معايير داخلية (13C-لاكتات، 13C3-بيروفات، 13C-ميثيونين، و13C6-إيزوليوسين، تم شراؤها من مختبرات Cambridge Isotope Laboratories).تم بعد ذلك طرد الخليط عند 15000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم نقل الطور السفلي إلى أنبوبين (125 ميكرولتر لكل منهما) لتحليل LC-MS في الأوضاع الإيجابية والسلبية.وأخيرا، تم تبخير العينة حتى تجف في مكثف فراغ عالي السرعة.
تم إعادة تكوين المستقلبات المجففة في 120 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 80٪، وتدويرها لمدة 5 دقائق، وطردها عند 15000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.تم نقل المواد الطافية إلى قوارير زجاجية كهرمانية تحتوي على إدخالات دقيقة لدراسات التمثيل الغذائي.تحليل التمثيل الغذائي غير المستهدف على منصة قياس الطيف الكتلي السائل عالي الأداء عالي الدقة (UPLC-HRMS).تم فصل المستقلبات باستخدام نظام Dionex Ultimate 3000 UPLC وعمود ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 مم، 1.7 ميكرومتر، المياه).في وضع الأيونات الإيجابية، كانت المراحل المتنقلة 95% (A) و 50% الاسيتو الانيتريل (B)، تحتوي كل منها على 10 مليمول/لتر خلات الأمونيوم وحمض الفورميك 0.1%.في الوضع السلبي، تحتوي المرحلتان المتنقلتان A وB على 95% و50% من الأسيتونيتريل، على التوالي، وتحتوي كلتا المرحلتين على 10 مليمول/لتر من خلات الأمونيوم، ودرجة الحموضة = 9. وكان برنامج التدرج كما يلي: 0–0.5 دقيقة، 2% B؛0.5 – 12 دقيقة، 2 – 50% ب؛12-14 دقيقة، 50-98% ب؛14-16 دقيقة، 98% ب؛16-16.1.الحد الأدنى، 98 –2% ب؛16.1-20 دقيقة، 2% B. تم الحفاظ على العمود عند 40 درجة مئوية والعينة عند 10 درجات مئوية في جهاز أخذ العينات التلقائي.وكان معدل التدفق 0.3 مل / دقيقة، وكان حجم الحقن 3 ميكرولتر.تم تشغيل مطياف الكتلة Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) مع مصدر التأين الكهربائي (ESI) في وضع المسح الكامل ومقترنًا بوضع المراقبة ddMS2 لجمع كميات كبيرة من البيانات.تم ضبط معلمات MS على النحو التالي: جهد الرش +3.8 كيلو فولت/- 3.2 كيلو فولت، درجة حرارة الشعيرات الدموية 320 درجة مئوية، غاز التدريع 40 بوصة، الغاز المساعد 10 بوصة، درجة حرارة سخان المسبار 350 درجة مئوية، نطاق المسح 70-1050 م / ساعة، دقة.70000. تم الحصول على البيانات باستخدام Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
لتقييم جودة البيانات، تم إنشاء عينات مراقبة الجودة المجمعة (QC) عن طريق إزالة 10 ميكرولتر من طاف من كل عينة.تم تحليل ستة حقن لعينات مراقبة الجودة في بداية التسلسل التحليلي لتقييم استقرار نظام UPLC-MS.يتم بعد ذلك إدخال عينات مراقبة الجودة بشكل دوري في الدفعة.تم تحليل جميع الدفعات الـ 11 من عينات المصل في هذه الدراسة بواسطة LC-MS.تم استخدام قسامات خليط تجمع المصل من 100 متبرع صحي كمواد مرجعية في الدفعات المعنية لمراقبة عملية الاستخراج وضبط التأثيرات من دفعة إلى دفعة.تم إجراء تحليل التمثيل الغذائي غير المستهدف لمجموعة الاكتشاف، ومجموعة التحقق من الصحة الداخلية، ومجموعة التحقق من الصحة الخارجية في مركز التمثيل الغذائي بجامعة صن يات صن.كما قام المختبر الخارجي لمركز التحليل والاختبار التكنولوجي بجامعة قوانغدونغ بتحليل 40 عينة من المجموعة الخارجية لاختبار أداء نموذج المصنف.
بعد الاستخراج وإعادة التكوين، تم قياس الكميات المطلقة لنواتج الأيض في المصل باستخدام قياس الطيف الكتلي السائل عالي الأداء جنبًا إلى جنب (Agilent 6495 ثلاثي الرباعي) مع مصدر التأين الكهربائي (ESI) في وضع مراقبة التفاعلات المتعددة (MRM).تم استخدام عمود ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 مم، 1.7 ميكرومتر، المياه) لفصل المستقلبات.يتكون الطور المتحرك من 90% (A) و5% أسيتونيتريل (B) مع 10 مليمول/لتر من خلات الأمونيوم ومحلول الأمونيا 0.1%.وكان برنامج التدرج على النحو التالي: 0-1.5 دقيقة، 0% ب؛1.5 – 6.5 دقيقة، 0 – 15% ب؛6.5-8 دقيقة، 15% ب؛8 – 8.5 دقيقة، 15% – 0% ب؛8.5-11.5 دقيقة، 0% ب.تم الحفاظ على العمود عند 40 درجة مئوية والعينة عند 10 درجات مئوية في جهاز أخذ العينات التلقائي.كان معدل التدفق 0.3 مل / دقيقة وكان حجم الحقن 1 ميكرولتر.تم تعيين معلمات MS على النحو التالي: الجهد الشعري ± 3.5 كيلو فولت، وضغط البخاخات 35 رطل لكل بوصة مربعة، وتدفق غاز الغمد 12 لتر / دقيقة، ودرجة حرارة غاز الغمد 350 درجة مئوية، ودرجة حرارة غاز التجفيف 250 درجة مئوية، وتدفق غاز التجفيف 14 لتر / دقيقة.كانت تحويلات MRM للتريبتوفان والبيروفات واللاكتات وهيبوكسانثين والزانثين 205.0-187.9 و87.0-43.4 و89.0-43.3 و135.0-92.3 و151.0-107.9 على التوالي.تم جمع البيانات باستخدام Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).بالنسبة لعينات المصل، تم قياس كمية التربتوفان والبيروفات واللاكتات والهيبوكسانثين والزانثين باستخدام منحنيات معايرة محاليل الخليط القياسية.بالنسبة لعينات الخلايا، تم تطبيع محتوى التربتوفان إلى المعيار الداخلي وكتلة البروتين الخلوي.
تم إجراء استخراج الذروة (m / z ووقت الاستبقاء (RT)) باستخدام Compound Discovery 3.1 وTraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).لإزالة الاختلافات المحتملة بين الدُفعات، تم تقسيم كل ذروة مميزة لعينة الاختبار على الذروة المميزة للمادة المرجعية من نفس الدفعة للحصول على الوفرة النسبية.يتم عرض الانحرافات المعيارية النسبية للمعايير الداخلية قبل وبعد التقييس في الجدول التكميلي 6. وقد تميزت الاختلافات بين المجموعتين بمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR <0.05، اختبار رتبة موقع ويلكوكسون) وتغيير الطية (> 1.2 أو <0.83).يتم عرض بيانات MS الأولية للميزات المستخرجة وبيانات MS المصححة بالمصل في البيانات التكميلية 1 والبيانات التكميلية 2 على التوالي.تم تنفيذ الشرح الذروة على أساس أربعة مستويات محددة من تحديد الهوية، بما في ذلك المستقلبات التي تم تحديدها، والمركبات المشروحة المفترضة، والفئات المركبة المميزة بشكل مفترض، والمركبات غير المعروفة 22.استنادًا إلى عمليات البحث في قاعدة البيانات في Compound Discovery 3.1 (mzCloud، HMDB، Chemspider)، تم أخيرًا اختيار المركبات البيولوجية ذات MS/MS المطابقة للمعايير المصادق عليها أو التعليقات التوضيحية المطابقة تمامًا في mzCloud (النتيجة > 85) أو Chemspider كوسيط بين المستقلب التفاضلي.يتم تضمين التعليقات التوضيحية الذروة لكل ميزة في البيانات التكميلية 3. تم استخدام MetaboAnalyst 5.0 للتحليل أحادي المتغير لوفرة المستقلبات المجمعة.قام MetaboAnalyst 5.0 أيضًا بتقييم تحليل إثراء مسار KEGG استنادًا إلى مستقلبات مختلفة بشكل كبير.تم تحليل تحليل المكون الرئيسي (PCA) والتحليل الجزئي لتمييز المربعات الصغرى (PLS-DA) باستخدام حزمة برامج robls (الإصدار 1.26.4) مع تطبيع المكدس والقياس التلقائي.تم إنشاء نموذج العلامة الحيوية الأيضية الأمثل للتنبؤ بالأورام الخبيثة العقيدية باستخدام الانحدار اللوجستي الثنائي مع أقل انكماش مطلق ومشغل الاختيار (LASSO، R package v.4.1-3).تميز أداء النموذج المميز في مجموعات الكشف والتحقق من الصحة بتقدير AUC بناءً على تحليل ROC وفقًا لحزمة pROC (الإصدار 1.18.0.).تم الحصول على قطع الاحتمال الأمثل بناءً على الحد الأقصى لمؤشر Youden للنموذج (الحساسية + الخصوصية - 1).سيتم التنبؤ بالعينات ذات القيم الأقل أو الأكبر من العتبة على أنها عقيدات حميدة وسرطان غدي رئوي، على التوالي.
تمت زراعة خلايا A549 (#CCL-185، مجموعة ثقافة النوع الأمريكية) في وسط F-12K يحتوي على 10% FBS.تم إدراج تسلسلات RNA (shRNA) قصيرة الشعر التي تستهدف SLC7A5 والتحكم غير المستهدف (NC) في ناقل الفيروسة البطيئة pLKO.1-puro.تسلسلات مضاد التحسس لـ shSLC7A5 هي كما يلي: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3 ′)، Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3 ′).تم شراء الأجسام المضادة لـ SLC7A5 (#5347) والتوبولين (#2148) من Cell Signaling Technology.تم استخدام الأجسام المضادة لـ SLC7A5 والتوبولين بتخفيف 1: 1000 لتحليل اللطخة الغربية.
يقيس اختبار إجهاد تحلل السكر Seahorse XF مستويات التحمض خارج الخلية (ECAR).في الاختبار، تم إعطاء الجلوكوز والأوليجوميسين A و2-DG بالتتابع لاختبار قدرة تحلل السكر الخلوية كما تم قياسها بواسطة ECAR.
تم طلاء الخلايا A549 المنقولة عن طريق التحكم غير المستهدف (NC) وshSLC7A5 (Sh1، Sh2) طوال الليل في أطباق قطرها 10 سم.تم استخلاص مستقلبات الخلية باستخدام 1 مل من الميثانول المائي المثلج بنسبة 80%.تم كشط الخلايا الموجودة في محلول الميثانول وجمعها في أنبوب جديد وطردها عند 15000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.جمع 800 ميكرولتر من طاف وجافة باستخدام مكثف فراغ عالي السرعة.تم بعد ذلك تحليل كريات المستقلب المجففة لمستويات التربتوفان باستخدام LC-MS/MS كما هو موضح أعلاه.تم قياس مستويات NAD (H) الخلوية في خلايا A549 (NC وshSLC7A5) باستخدام مجموعة قياس الألوان NAD +/NADH الكمية (#K337، BioVision) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.تم قياس مستويات البروتين لكل عينة لتطبيع كمية المستقلبات.
لم يتم استخدام أي طرق إحصائية لتحديد حجم العينة بشكل مبدئي.وقد اعتبرت الدراسات الاستقلابية السابقة التي تهدف إلى اكتشاف العلامات الحيوية بمثابة معايير لتحديد الحجم، وبالمقارنة مع هذه التقارير، كانت عينتنا كافية.ولم يتم استبعاد أي عينات من مجموعة الدراسة.تم تخصيص عينات المصل بشكل عشوائي لمجموعة اكتشاف (306 حالة، 74.6٪) ومجموعة التحقق الداخلية (104 حالة، 25.4٪) لدراسات التمثيل الغذائي غير المستهدفة.لقد اخترنا أيضًا 70 حالة بشكل عشوائي من كل مجموعة من مجموعة الاكتشاف لدراسات التمثيل الغذائي المستهدفة.لقد أعمى المحققون عن مهمة المجموعة أثناء جمع وتحليل بيانات LC-MS.تم وصف التحليلات الإحصائية لبيانات التمثيل الغذائي وتجارب الخلايا في أقسام النتائج وأساطير الشكل والطرق المعنية.تم إجراء القياس الكمي لنشاط التربتوفان الخلوي وNADT وتحلل السكر ثلاث مرات بشكل مستقل مع نتائج متطابقة.
لمزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص تقرير المحفظة الطبيعية المرتبط بهذه المقالة.
تظهر بيانات MS الأولية للميزات المستخرجة وبيانات MS الطبيعية للمصل المرجعي في البيانات التكميلية 1 والبيانات التكميلية 2 على التوالي.يتم عرض التعليقات التوضيحية الذروة للميزات التفاضلية في البيانات التكميلية 3. ويمكن تنزيل مجموعة بيانات LUAD TCGA من https://portal.gdc.cancer.gov/.يتم توفير بيانات الإدخال لتخطيط الرسم البياني في البيانات المصدر.يتم توفير بيانات المصدر لهذه المقالة.
مجموعة الدراسة الوطنية لفحص الرئة، وما إلى ذلك. تقليل معدل الوفيات بسرطان الرئة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة.شمال انجلترا.جيه ميد.365، 395-409 (2011).
Kramer، BS، Berg، KD، Aberle، DR and Prophet، PC فحص سرطان الرئة باستخدام جرعة منخفضة من التصوير المقطعي الحلزوني: نتائج الدراسة الوطنية لفحص الرئة (NLST).جيه ميد.شاشة 18، ​​109-111 (2011).
دي كونينج، هج، وآخرون.تقليل معدل الوفيات بسرطان الرئة من خلال الفحص الحجمي بالأشعة المقطعية في تجربة عشوائية.شمال انجلترا.جيه ميد.382، 503-513 (2020).