لا يزال التشخيص التفريقي للعقيدات الرئوية التي يتم تحديدها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب (CT) يمثل تحديًا في الممارسة السريرية. في هذه الدراسة، قمنا بتوصيف الميتابولوم الشامل لـ 480 عينة مصل، شملت عينات من أشخاص أصحاء، وعقيدات رئوية حميدة، وسرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى. تُظهر الأورام الغدية السرطانية أنماطًا ميتابولومية فريدة، بينما تتشابه العقيدات الحميدة والأفراد الأصحاء بشكل كبير في أنماطهم الميتابولومية. في مجموعة الاكتشاف (ن = 306)، تم تحديد مجموعة من 27 مستقلبًا للتمييز بين العقيدات الحميدة والخبيثة. بلغت مساحة المنطقة تحت المنحنى (AUC) للنموذج التمييزي في مجموعتي التحقق الداخلي (ن = 104) والتحقق الخارجي (ن = 111) 0.915 و0.945 على التوالي. كشف تحليل المسارات الأيضية عن زيادة في نواتج أيض الجلوكوز المرتبطة بانخفاض مستوى التربتوفان في مصل مرضى سرطان الرئة الغدي مقارنةً بالعُقيدات الحميدة والأفراد الأصحاء، مما يشير إلى أن امتصاص التربتوفان يعزز عملية تحلل الجلوكوز في خلايا سرطان الرئة. تُبرز دراستنا أهمية المؤشرات الحيوية الأيضية في مصل الدم في تقييم خطر الإصابة بالعُقيدات الرئوية التي يتم الكشف عنها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب.
يُعد التشخيص المبكر بالغ الأهمية لتحسين معدلات بقاء مرضى السرطان على قيد الحياة. وقد أظهرت نتائج التجربة الوطنية الأمريكية لفحص سرطان الرئة (NLST) ودراسة NELSON الأوروبية أن الفحص باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة (LDCT) يُمكن أن يُقلل بشكل كبير من وفيات سرطان الرئة لدى الفئات عالية الخطورة1،2،3. ومنذ الانتشار الواسع لاستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة لفحص سرطان الرئة، استمرت نسبة اكتشاف العُقيدات الرئوية غير المصحوبة بأعراض في الازدياد4. تُعرَّف العُقيدات الرئوية بأنها بؤر معتمة يصل قطرها إلى 3 سم5. نواجه صعوبات في تقييم احتمالية الإصابة بالسرطان والتعامل مع العدد الكبير من العُقيدات الرئوية التي يتم اكتشافها عرضيًا في التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة. قد تؤدي محدودية التصوير المقطعي المحوسب إلى فحوصات متابعة متكررة ونتائج إيجابية خاطئة، مما يؤدي إلى تدخلات غير ضرورية وعلاج مفرط6. لذلك، ثمة حاجة لتطوير مؤشرات حيوية موثوقة ومفيدة لتحديد سرطان الرئة بدقة في مراحله المبكرة والتمييز بين معظم العُقيدات الحميدة عند الكشف الأولي7.
أدى التحليل الجزيئي الشامل للدم (المصل، البلازما، خلايا الدم أحادية النواة الطرفية)، بما في ذلك علم الجينوم، وعلم البروتينات، ومَثْيَلَة الحمض النووي 8،9،10، إلى تزايد الاهتمام باكتشاف المؤشرات الحيوية التشخيصية لسرطان الرئة. في الوقت نفسه، تقيس مناهج علم الأيض النواتج الخلوية النهائية المتأثرة بعوامل داخلية وخارجية، وبالتالي تُستخدم للتنبؤ ببدء المرض ومآله. يُعدّ الاستشراب السائل - مطياف الكتلة الترادفي (LC-MS) طريقة شائعة الاستخدام في دراسات علم الأيض نظرًا لحساسيته العالية ونطاقه الديناميكي الواسع، الذي يُمكنه تغطية الأيضات ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة 11،12،13. على الرغم من استخدام التحليل الأيضي الشامل للبلازما/المصل لتحديد المؤشرات الحيوية المرتبطة بتشخيص سرطان الرئة 14،15،16،17 وفعالية العلاج 18، إلا أن مُصنِّفات الأيضات في المصل للتمييز بين عقيدات الرئة الحميدة والخبيثة لا تزال بحاجة إلى مزيد من البحث المكثف.
يُعدّ سرطان الغدد وسرطان الخلايا الحرشفية النوعين الرئيسيين لسرطان الرئة ذي الخلايا غير الصغيرة. وتشير فحوصات التصوير المقطعي المحوسب المختلفة إلى أن سرطان الغدد هو النمط النسيجي الأكثر شيوعًا لسرطان الرئة1,19,20,21. في هذه الدراسة، استخدمنا تقنية كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء المقترنة بقياس الطيف الكتلي عالي الدقة (UPLC-HRMS) لإجراء تحليل أيضي على 695 عينة مصل، شملت عينات من أشخاص أصحاء، وعقيدات رئوية حميدة، وأورام رئوية بحجم ≤3 سم تم الكشف عنها بالتصوير المقطعي المحوسب للكشف عن سرطان الغدد الرئوي في المرحلة الأولى. وقد حددنا مجموعة من مستقلبات المصل التي تميز سرطان الغدد الرئوي عن العقيدات الحميدة والأشخاص الأصحاء. وكشف تحليل إثراء المسارات الأيضية أن اضطرابات استقلاب التربتوفان والجلوكوز من التغيرات الشائعة في سرطان الغدد الرئوي مقارنةً بالعقيدات الحميدة والأشخاص الأصحاء. وأخيراً، قمنا بإنشاء وتأكيد مصنف استقلابي للمصل يتميز بدرجة عالية من الخصوصية والحساسية للتمييز بين العُقيدات الرئوية الخبيثة والحميدة التي تم الكشف عنها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب منخفض الجرعة، مما قد يساعد في التشخيص التفريقي المبكر وتقييم المخاطر.
في هذه الدراسة، جُمعت عينات مصل الدم، متطابقة من حيث الجنس والعمر، بأثر رجعي من 174 شخصًا سليمًا، و292 مريضًا مصابًا بعقيدات رئوية حميدة، و229 مريضًا مصابًا بسرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى. وتُعرض الخصائص الديموغرافية للمشاركين الـ 695 في الجدول التكميلي 1.
كما هو موضح في الشكل 1أ، جُمعت 480 عينة مصل في مركز صن يات صن الجامعي للسرطان، شملت 174 عينة من الأفراد الأصحاء (مجموعة الضبط)، و170 عينة من العُقيدات الحميدة (BN)، و136 عينة من سرطان غدي رئوي في المرحلة الأولى (LA). استُخدمت هذه المجموعة الاستكشافية لتحليل الميتابولوم غير الموجه باستخدام تقنية كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء المقترنة بقياس الطيف الكتلي عالي الدقة (UPLC-HRMS). وكما هو موضح في الشكل التكميلي 1، حُددت المستقلبات المختلفة بين LA وHC، وبين LA وBN، وذلك لإنشاء نموذج تصنيفي واستكشاف تحليل المسارات التفاضلية بشكل أعمق. خضعت 104 عينات جُمعت في مركز صن يات صن الجامعي للسرطان، و111 عينة جُمعت في مستشفيين آخرين، للتحقق الداخلي والخارجي على التوالي.
أ- عينة الدراسة ضمن مجموعة الاكتشاف التي خضعت لتحليل الميتابولوميات المصلية الشاملة باستخدام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء المقترنة بقياس الطيف الكتلي عالي الدقة (UPLC-HRMS). ب- تحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA) للميتابولوم الكلي لـ 480 عينة مصل من مجموعة الدراسة، بما في ذلك الضوابط الصحية (HC، ن = 174)، والعقيدات الحميدة (BN، ن = 170)، وسرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى (لوس أنجلوس، ن = 136). +ESI: وضع التأين بالرذاذ الإلكتروني الموجب، -ESI: وضع التأين بالرذاذ الإلكتروني السالب. ج-هـ- تُظهر الأشكال البيانية البركانية المستقلبات ذات الوفرة المختلفة بشكل ملحوظ في مجموعتين محددتين (اختبار ويلكوكسون ذو الرتب الموقعة ثنائي الطرف، قيمة p المعدلة لمعدل الاكتشاف الخاطئ، FDR < 0.05) باللون الأحمر (تغير الطي > 1.2) والأزرق (تغير الطي < 0.83). خريطة حرارية للتجميع الهرمي تُظهر اختلافات كبيرة في عدد المستقلبات المُعَلَّمة بين LA وBN. يتم توفير بيانات المصدر في شكل ملفات بيانات المصدر.
تم تحليل الميتابولوم الكلي لمصل الدم لـ 174 فردًا من مجموعة الاكتشاف (HC)، و170 فردًا من مجموعة BN، و136 فردًا من مجموعة LA) باستخدام تحليل UPLC-HRMS. أظهرنا أولًا أن عينات مراقبة الجودة (QC) تتجمع بإحكام في مركز نموذج تحليل المكونات الرئيسية غير الخاضع للإشراف (PCA)، مما يؤكد استقرار أداء هذه الدراسة (الشكل التكميلي 2).
كما هو موضح في تحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA) في الشكل 1 ب، وجدنا اختلافات واضحة بين LA وBN، وLA وHC في نمطي التأين بالرذاذ الإلكتروني الموجب (+ESI) والسالب (-ESI). ومع ذلك، لم تُلاحظ اختلافات جوهرية بين BN وHC في ظروف +ESI و-ESI.
وجدنا 382 سمة تفاضلية بين مجموعتي LA وHC، و231 سمة تفاضلية بين مجموعتي LA وBN، و95 سمة تفاضلية بين مجموعتي BN وHC (اختبار ويلكوكسون للإشارة المرتبة، FDR < 0.05 وتغير متعدد > 1.2 أو < 0.83) (الشكل 1 ج-هـ). تمت إضافة تعليقات توضيحية للقمم (البيانات التكميلية 3) بالرجوع إلى قاعدة بيانات (مكتبة mzCloud/HMDB/Chemspider) باستخدام قيمة m/z، ووقت الاحتفاظ، والبحث في طيف الكتلة للتجزئة (التفاصيل موضحة في قسم الطرق) 22. وأخيرًا، تم تحديد 33 و38 مستقلبًا مُعلَّقًا باختلافات معنوية في الوفرة لمجموعة LA مقابل BN (الشكل 1 و والجدول التكميلي 2) ومجموعة LA مقابل HC (الشكل التكميلي 3 والجدول التكميلي 2)، على التوالي. في المقابل، لم يُحدد سوى 3 مستقلبات ذات اختلافات معنوية في وفرتها بين مجموعتي BN وHC (الجدول التكميلي 2)، وهو ما يتوافق مع التداخل بينهما في تحليل PLS-DA. تغطي هذه المستقلبات المتباينة نطاقًا واسعًا من المواد الكيميائية الحيوية (الشكل التكميلي 4). تُظهر هذه النتائج مجتمعةً تغيراتٍ معنويةً في ميتابولوم المصل تعكس التحول الخبيث لسرطان الرئة في مراحله المبكرة مقارنةً بعقيدات الرئة الحميدة أو الأفراد الأصحاء. في الوقت نفسه، يشير تشابه ميتابولوم المصل بين BN وHC إلى أن عقيدات الرئة الحميدة قد تشترك في العديد من الخصائص البيولوجية مع الأفراد الأصحاء. نظرًا لشيوع طفرات جين مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) في النوع الفرعي 23 من سرطان غدي الرئة، سعينا إلى تحديد تأثير الطفرات المحفزة على ميتابولوم المصل. ثم قمنا بتحليل المظهر الميتابولومي العام لـ 72 حالةً مع تحديد حالة EGFR في مجموعة سرطان غدي الرئة. ومن المثير للاهتمام، أننا وجدنا أنماطًا متقاربة بين المرضى الذين يحملون طفرة في جين EGFR (ن = 41) والمرضى الذين لا يحملون هذه الطفرة (ن = 31) في تحليل المكونات الرئيسية (الشكل التكميلي 5أ). مع ذلك، حددنا 7 مستقلبات تغيرت وفرتها بشكل ملحوظ لدى المرضى الذين يحملون طفرة في جين EGFR مقارنةً بالمرضى الذين لا يحملون هذه الطفرة (اختبار t، قيمة p < 0.05، ونسبة التغير > 1.2 أو < 0.83) (الشكل التكميلي 5ب). معظم هذه المستقلبات (5 من أصل 7) هي أسيل كارنيتينات، والتي تلعب دورًا هامًا في مسارات أكسدة الأحماض الدهنية.
كما هو موضح في سير العمل في الشكل 2 أ، تم الحصول على المؤشرات الحيوية لتصنيف العُقيدات باستخدام مُعاملات الانكماش المطلق الأدنى، والاختيار بناءً على 33 مُستقلبًا تفاضليًا تم تحديدها في LA (عددها 136) وBN (عددها 170). تم استخدام نموذج الانحدار اللوجستي الثنائي (LASSO) لأفضل توليفة من المتغيرات. استُخدم التحقق المتقاطع ذو العشر طيات لاختبار موثوقية النموذج. تم ضبط اختيار المتغيرات وتنظيم المعلمات باستخدام عقوبة تعظيم الاحتمالية مع المعلمة λ24. أُجري تحليل شامل للمستقلبات بشكل مستقل في مجموعتي التحقق الداخلي (عددها 104) والتحقق الخارجي (عددها 111) لاختبار أداء تصنيف النموذج التمييزي. ونتيجة لذلك، تم تحديد 27 مُستقلبًا في مجموعة الاكتشاف كأفضل نموذج تمييزي بأعلى متوسط قيمة AUC (الشكل 2 ب)، من بينها 9 مُستقلبات ذات نشاط متزايد و18 مُستقلبات ذات نشاط مُنخفض في LA مقارنةً بـBN (الشكل 2 ج).
أ- سير العمل لبناء مصنف للعقيدات الرئوية، بما في ذلك اختيار أفضل مجموعة من مستقلبات المصل في مجموعة الاكتشاف باستخدام نموذج الانحدار اللوجستي الثنائي عبر التحقق المتبادل ذي العشر طيات، وتقييم الأداء التنبؤي في مجموعات التحقق الداخلية والخارجية. ب- إحصائيات التحقق المتبادل لنموذج انحدار LASSO لاختيار المؤشرات الحيوية الأيضية. تمثل الأرقام المذكورة أعلاه متوسط عدد المؤشرات الحيوية المختارة عند قيمة λ معينة. يمثل الخط الأحمر المتقطع متوسط قيمة AUC عند قيمة λ المقابلة. تمثل أشرطة الخطأ الرمادية الحد الأدنى والحد الأقصى لقيم AUC. يشير الخط المتقطع إلى أفضل نموذج مع 27 مؤشرًا حيويًا مختارًا. AUC، المساحة تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC). ج- التغيرات في 27 مستقلبًا مختارًا في مجموعة LA مقارنةً بمجموعة BN في مجموعة الاكتشاف. العمود الأحمر - التنشيط. العمود الأزرق - الانخفاض. منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) من د إلى و توضح قوة النموذج التمييزي بناءً على 27 تركيبة من المستقلبات في مجموعات الاكتشاف والتحقق الداخلي والخارجي. يتم توفير بيانات المصدر في شكل ملفات بيانات المصدر.
تم إنشاء نموذج تنبؤي بناءً على معاملات الانحدار المرجحة لهذه المستقلبات الـ 27 (الجدول التكميلي 3). أظهر تحليل منحنى ROC، استنادًا إلى هذه المستقلبات، قيمة مساحة تحت المنحنى (AUC) قدرها 0.933، وحساسية مجموعة الاكتشاف 0.868، وخصوصية 0.859 (الشكل 2د). في الوقت نفسه، من بين المستقلبات التفاضلية الـ 38 المصنفة بين LA وHC، حققت مجموعة من 16 مستقلبًا قيمة AUC قدرها 0.902 مع حساسية 0.801 وخصوصية 0.856 في التمييز بين LA وHC (الشكل التكميلي 6أ-ج). كما تمت مقارنة قيم AUC بناءً على عتبات تغيير الطي المختلفة للمستقلبات التفاضلية. ووجدنا أن نموذج التصنيف كان الأفضل أداءً في التمييز بين LA وBN (HC) عندما تم ضبط مستوى تغيير الطي على 1.2 مقابل 1.5 أو 2.0 (الشكل التكميلي 7أ، ب). تم التحقق من صحة نموذج التصنيف، القائم على 27 مجموعة من المستقلبات، في مجموعتين داخليتين وخارجيتين. بلغت مساحة المنطقة تحت المنحنى (AUC) 0.915 (حساسية 0.867، نوعية 0.811) للتحقق الداخلي، و0.945 (حساسية 0.810، نوعية 0.979) للتحقق الخارجي (الشكل 2هـ، و). ولتقييم كفاءة التحليل بين المختبرات، تم تحليل 40 عينة من المجموعة الخارجية في مختبر خارجي كما هو موضح في قسم الطرق. وحققت دقة التصنيف مساحة منطقة تحت المنحنى (AUC) قدرها 0.925 (الشكل التكميلي 8). ولأن سرطان الخلايا الحرشفية الرئوي (LUSC) هو ثاني أكثر أنواع سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) شيوعًا بعد سرطان الغدد الرئوية (LUAD)، فقد اختبرنا أيضًا الفائدة المحتملة المُثبتة للملامح الأيضية. تم تحليل 16 حالة من سرطان الخلايا الحرشفية الرئوي (LUSC) و16 حالة من سرطان الخلايا الحرشفية الرئوي (LUSC). بلغت مساحة المنطقة تحت المنحنى (AUC) للتمييز بين سرطان الرئة ذي الخلايا الحرشفية (LUSC) وسرطان الرئة ذي الخلايا العصبية (BN) 0.776 (الشكل التكميلي 9)، مما يشير إلى قدرة أضعف مقارنة بالتمييز بين سرطان الرئة الغدي (LUAD) وسرطان الرئة ذي الخلايا العصبية (BN).
أظهرت الدراسات أن حجم العُقيدات في صور الأشعة المقطعية يرتبط ارتباطًا إيجابيًا باحتمالية الإصابة بالسرطان، ويظل عاملًا رئيسيًا في تحديد علاج العُقيدات25،26،27. وأظهر تحليل بيانات من مجموعة كبيرة من دراسة نيلسون للفحص أن خطر الإصابة بالسرطان لدى الأفراد الذين لديهم عُقيدات أقل من 5 مم كان مشابهًا لخطر الإصابة لدى الأفراد الذين لا يعانون من عُقيدات28. لذا، فإن الحد الأدنى للحجم الذي يتطلب مراقبة منتظمة بالأشعة المقطعية هو 5 مم، وفقًا لتوصيات الجمعية البريطانية لأمراض الصدر، و6 مم، وفقًا لتوصيات جمعية فليشنر29. ومع ذلك، فإن العُقيدات التي يزيد حجمها عن 6 مم والتي لا تظهر عليها سمات حميدة واضحة، والتي تُسمى العُقيدات الرئوية غير المحددة، لا تزال تُمثل تحديًا كبيرًا في التقييم والإدارة في الممارسة السريرية30،31. بعد ذلك، فحصنا ما إذا كان حجم العُقيدات يؤثر على البصمات الأيضية باستخدام عينات مُجمعة من مجموعتي الاكتشاف والتحقق الداخلي. بالتركيز على 27 مؤشرًا حيويًا مُثبتًا، قارنّا أولًا ملامح تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لمجموعات الأيض في كل من HC وBN التي يقل حجمها عن 6 مم. وجدنا أن معظم نقاط البيانات لكل من HC وBN متداخلة، مما يدل على تشابه مستويات الأيض في مصل الدم لدى المجموعتين (الشكل 3أ). حافظت خرائط الخصائص عبر نطاقات الأحجام المختلفة على ثباتها في BN وLA (الشكل 3ب، ج)، بينما لوحظ فصل بين العُقيدات الخبيثة والحميدة في نطاق 6-20 مم (الشكل 3د). بلغت مساحة المنطقة تحت المنحنى (AUC) لهذه المجموعة 0.927، والنوعية 0.868، والحساسية 0.820 في التنبؤ بخباثة العُقيدات التي يتراوح حجمها بين 6 و20 مم (الشكل 3هـ، و). تُظهر نتائجنا أن المُصنِّف قادر على رصد التغيرات الأيضية الناتجة عن التحول الخبيث المبكر، بغض النظر عن حجم العُقيدة.
أ- مقارنة ملامح تحليل المكونات الرئيسية (PCA) بين مجموعات محددة بناءً على مصنف أيضي مكون من 27 مستقلباً. ب- سرطان القولون والمستقيم (CC) وعقدة عضلية (BN) < 6 مم. ج- عقدة عضلية < 6 مم مقابل عقدة عضلية 6-20 مم. د- عقدة عضلية 6-20 مم مقابل عقدة عضلية 20-30 مم. هـ- عقدة عضلية 6-20 مم وعقدة عضلية 6-20 مم. و- سرطان المعدة (GC)، ن = 174؛ عقدة عضلية < 6 مم، ن = 153؛ عقدة عضلية 6-20 مم، ن = 91؛ عقدة عضلية 6-20 مم، ن = 89؛ عقدة عضلية 20-30 مم، ن = 77. ز- منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) الذي يوضح أداء النموذج التمييزي للعقد 6-20 مم. ح- تم حساب قيم الاحتمالية بناءً على نموذج الانحدار اللوجستي للعقد التي يتراوح قياسها بين 6 و20 مم. يمثل الخط الرمادي المنقط قيمة القطع المثلى (0.455). تمثل الأرقام أعلاه النسبة المئوية للحالات المتوقعة في لوس أنجلوس. استخدم اختبار t للطالب ذي الطرفين. PCA: تحليل المكونات الرئيسية. AUC: المساحة تحت المنحنى. بيانات المصدر متوفرة في شكل ملفات بيانات المصدر.
تم اختيار أربع عينات (أعمارهم بين 44 و61 عامًا) ذات أحجام عقيدات رئوية متقاربة (7-9 مم) لتوضيح أداء نموذج التنبؤ بالخباثة المقترح (الشكل 4أ، ب). في الفحص الأولي، ظهرت الحالة 1 كعقيدة صلبة متكلسة، وهي سمة مرتبطة بالخباثة، بينما ظهرت الحالة 2 كعقيدة صلبة جزئيًا غير محددة المعالم دون أي سمات حميدة واضحة. أظهرت ثلاث جولات من فحوصات التصوير المقطعي المحوسب للمتابعة أن هاتين الحالتين ظلتا مستقرتين على مدى أربع سنوات، ولذلك اعتُبرتا عقيدات حميدة (الشكل 4أ). بالمقارنة مع التقييم السريري لفحوصات التصوير المقطعي المحوسب المتسلسلة، حدد تحليل مستقلبات المصل أحادي اللقطة باستخدام نموذج التصنيف الحالي هذه العقيدات الحميدة بسرعة ودقة بناءً على القيود الاحتمالية (الجدول 1). يوضح الشكل 4ب في الحالة 3 عقيدة عليها علامات انكماش الجنبة، وهو ما يرتبط غالبًا بالخباثة. ظهرت الحالة الرابعة على شكل عقدة غير محددة، صلبة جزئيًا، دون وجود دليل على سبب حميد. وقد صُنفت جميع هذه الحالات على أنها خبيثة وفقًا لنموذج التصنيف (الجدول 1). وأُثبت تشخيص سرطان غدي رئوي من خلال الفحص النسيجي المرضي بعد جراحة استئصال الرئة (الشكل 4ب). وفي مجموعة التحقق الخارجية، تنبأ المصنف الأيضي بدقة بحالتين من العقد الرئوية غير المحددة التي يزيد حجمها عن 6 مم (الشكل التكميلي 10).
صور مقطعية محورية للرئتين لحالتين من العُقيدات الحميدة. في الحالة الأولى، أظهرت الأشعة المقطعية بعد 4 سنوات عُقيدة صلبة مستقرة بقطر 7 مم مع تكلس في الفص السفلي الأيمن. في الحالة الثانية، كشفت الأشعة المقطعية بعد 5 سنوات عن عُقيدة مستقرة، صلبة جزئيًا، بقطر 7 مم في الفص العلوي الأيمن. ب- صور مقطعية محورية للرئتين ودراسات مرضية مقابلة لحالتين من سرطان غدي من المرحلة الأولى قبل استئصال الرئة. كشفت الحالة الثالثة عن عُقيدة بقطر 8 مم في الفص العلوي الأيمن مع انكماش الجنبة. كشفت الحالة الرابعة عن عُقيدة صلبة جزئيًا ذات مظهر زجاجي معتم بقطر 9 مم في الفص العلوي الأيسر. تلوين نسيج الرئة المستأصل بالهيماتوكسيلين والإيوسين (مقياس الرسم = 50 ميكرومتر) يوضح نمط النمو العنيبي لسرطان الرئة الغدي. تشير الأسهم إلى العُقيدات المكتشفة في الصور المقطعية. صور H&E هي صور تمثيلية لعدة حقول مجهرية (>3) قام أخصائي علم الأمراض بفحصها.
تُظهر نتائجنا مجتمعة القيمة المحتملة للعلامات الحيوية الأيضية في مصل الدم في التشخيص التفريقي للعقيدات الرئوية، والتي قد تشكل تحديات عند تقييم فحص التصوير المقطعي المحوسب.
استنادًا إلى مجموعة مُدققة من المستقلبات التفاضلية، سعينا إلى تحديد المؤشرات البيولوجية للتغيرات الأيضية الرئيسية. كشف تحليل إثراء مسارات KEGG باستخدام MetaboAnalyst عن 6 مسارات مشتركة متغيرة بشكل ملحوظ بين المجموعتين (LA مقابل HC وLA مقابل BN، قيمة p المعدلة ≤ 0.001، التأثير > 0.01). تميزت هذه التغيرات باضطرابات في استقلاب البيروفات، واستقلاب التربتوفان، واستقلاب النياسين والنيكوتيناميد، وتحلل الجلوكوز، ودورة حمض الستريك، واستقلاب البيورين (الشكل 5أ). ثم أجرينا تحليلًا استقلابيًا مُستهدفًا للتحقق من التغيرات الرئيسية باستخدام التحديد الكمي المطلق. تم تحديد المستقلبات المشتركة في المسارات المتغيرة بشكل شائع باستخدام مطياف الكتلة ثلاثي الأقطاب (QQQ) باستخدام معايير مستقلة أصلية. تُدرج الخصائص الديموغرافية لعينة الدراسة المستهدفة في دراسة الأيض في الجدول التكميلي 4. وتماشياً مع نتائجنا الشاملة في دراسة الأيض، أكد التحليل الكمي ارتفاع مستويات الهيبوكسانثين والزانثين والبيروفات واللاكتات في مجموعة LA مقارنةً بمجموعتي BN وHC (الشكل 5ب، ج، p < 0.05). مع ذلك، لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في هذه المستقلبات بين مجموعتي BN وHC.
تحليل إثراء مسارات KEGG للمستقلبات المختلفة بشكلٍ ملحوظ في مجموعة LA مقارنةً بمجموعتي BN وHC. استُخدم اختبار Globaltest ثنائي الطرف، وتم تعديل قيم p باستخدام طريقة Holm-Bonferroni (قيمة p المعدلة ≤ 0.001 وحجم التأثير > 0.01). ب-د: مخططات الكمان التي تُظهر مستويات الهيبوكسانثين، والزانثين، واللاكتات، والبيروفات، والتريبتوفان في مصل HC وBN وLA، والتي تم تحديدها بواسطة LC-MS/MS (n = 70 لكل مجموعة). تشير الخطوط المنقطة البيضاء والسوداء إلى الوسيط والربيعي، على التوالي. هـ: مخطط الكمان الذي يُظهر التعبير الجيني المُعدَّل Log2TPM (النسخ لكل مليون) لـ mRNA لكل من SLC7A5 وQPRT في سرطان غدي رئوي (n = 513) مقارنةً بنسيج الرئة الطبيعي (n = 59) في مجموعة بيانات LUAD-TCGA. يمثل المربع الأبيض المدى الربيعي، ويمثل الخط الأسود الأفقي في المنتصف الوسيط، ويمثل الخط الأسود الرأسي الممتد من المربع فاصل الثقة 95%. و- مخطط ارتباط بيرسون لتعبير SLC7A5 وGAPDH في سرطان غدي رئوي (ن = 513) وأنسجة رئوية طبيعية (ن = 59) في مجموعة بيانات TCGA. تمثل المنطقة الرمادية فاصل الثقة 95%. ر، معامل ارتباط بيرسون. ز- مستويات التربتوفان الخلوية المُعَيَّرة في خلايا A549 المُعدَّلة وراثيًا باستخدام shRNA غير النوعي للتحكم (NC) وshSLC7A5 (Sh1، Sh2) والمُحدَّدة بواسطة LC-MS/MS. يُقدَّم التحليل الإحصائي لخمس عينات مستقلة بيولوجيًا في كل مجموعة. ح- المستويات الخلوية لـ NADt (إجمالي NAD، بما في ذلك NAD+ وNADH) في خلايا A549 (NC) وخلايا A549 المُثبَّطة لـ SLC7A5 (Sh1، Sh2). يُعرض هنا تحليل إحصائي لثلاث عينات مستقلة بيولوجيًا في كل مجموعة. تم قياس النشاط الجليكولي لخلايا A549 قبل وبعد تثبيط جين SLC7A5 باستخدام معدل تحمض الوسط خارج الخلوي (ECAR) (عدد العينات المستقلة بيولوجيًا لكل مجموعة = 4). استُخدم اختبار t للطالب ثنائي الطرف في (ب-ح). في (ز-ط)، تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± الانحراف المعياري، وقد أُجريت كل تجربة ثلاث مرات بشكل مستقل وكانت النتائج متقاربة. تُقدم البيانات المصدرية في شكل ملفات بيانات مصدرية.
نظراً للتأثير الكبير لاضطراب استقلاب التربتوفان في مجموعة LA، قمنا أيضاً بتقييم مستويات التربتوفان في مصل الدم لدى مجموعات HC وBN وLA باستخدام تقنية QQQ. وجدنا انخفاضاً في مستوى التربتوفان في مصل الدم لدى مجموعة LA مقارنةً بمجموعتي HC وBN (p < 0.001، الشكل 5d)، وهو ما يتوافق مع نتائج سابقة تشير إلى انخفاض مستويات التربتوفان في الدورة الدموية لدى مرضى سرطان الرئة مقارنةً بالأفراد الأصحاء من المجموعة الضابطة33،34،35. وفي دراسة أخرى باستخدام متتبع PET/CT، وهو 11C-ميثيل-L-تربتوفان، تبين أن زمن احتفاظ إشارة التربتوفان في أنسجة سرطان الرئة يزداد بشكل ملحوظ مقارنةً بالآفات الحميدة أو الأنسجة الطبيعية36. نفترض أن انخفاض التربتوفان في مصل دم مجموعة LA قد يعكس امتصاصاً نشطاً للتربتوفان من قِبَل خلايا سرطان الرئة.
من المعروف أيضًا أن الناتج النهائي لمسار الكينورينين في هدم التربتوفان هو NAD+37,38، وهو ركيزة مهمة لتفاعل جليسرالدهيد-3-فوسفات مع 1،3-ثنائي فوسفوجليسيرات في عملية تحلل الجلوكوز39. في حين ركزت الدراسات السابقة على دور هدم التربتوفان في تنظيم المناعة، سعينا في هذه الدراسة إلى توضيح التفاعل بين اضطراب التربتوفان ومسارات تحلل الجلوكوز التي لوحظت. يُعرف ناقل المذاب من العائلة 7، العضو 5 (SLC7A5) بأنه ناقل للتربتوفان43,44,45. أما إنزيم فوسفوريبوزيل ترانسفيراز حمض الكينولينيك (QPRT) فهو إنزيم يقع في اتجاه مجرى مسار الكينورينين، ويحول حمض الكينولينيك إلى NAMN46. أظهر فحص مجموعة بيانات LUAD TCGA ارتفاعًا ملحوظًا في مستويات كل من SLC7A5 وQPRT في الأنسجة السرطانية مقارنةً بالأنسجة الطبيعية (الشكل 5هـ). وقد لوحظ هذا الارتفاع في المرحلتين الأولى والثانية، وكذلك في المرحلتين الثالثة والرابعة من سرطان الرئة الغدي (الشكل التكميلي 11)، مما يشير إلى اضطرابات مبكرة في استقلاب التربتوفان مرتبطة بتكوّن الأورام.
بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مجموعة بيانات LUAD-TCGA ارتباطًا إيجابيًا بين التعبير الجيني لـ SLC7A5 وGAPDH في عينات مرضى السرطان (r = 0.45، p = 1.55E-26، الشكل 5f). في المقابل، لم يُلاحظ أي ارتباط ذي دلالة إحصائية بين هذه البصمات الجينية في أنسجة الرئة الطبيعية (r = 0.25، p = 0.06، الشكل 5f). أدى تثبيط SLC7A5 (الشكل التكميلي 12) في خلايا A549 إلى انخفاض ملحوظ في مستويات التربتوفان وNAD(H) الخلوية (الشكل 5g، h)، مما نتج عنه انخفاض في نشاط تحلل الجلوكوز كما تم قياسه بمعدل تحمض الوسط خارج الخلوي (ECAR) (الشكل 1). 5i). بناءً على التغيرات الأيضية في المصل والكشف المختبري، نفترض أن استقلاب التربتوفان قد يُنتج NAD+ عبر مسار الكينورينين، ويلعب دورًا هامًا في تعزيز تحلل الجلوكوز في سرطان الرئة.
أظهرت الدراسات أن العدد الكبير من العُقيدات الرئوية غير المحددة التي يتم الكشف عنها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب منخفض الجرعة قد يؤدي إلى الحاجة إلى فحوصات إضافية مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني، وخزعة الرئة، والإفراط في العلاج بسبب التشخيص الإيجابي الكاذب للأورام الخبيثة.31 وكما هو موضح في الشكل 6، حددت دراستنا مجموعة من مستقلبات المصل ذات قيمة تشخيصية محتملة قد تُحسّن من تصنيف المخاطر والإدارة اللاحقة للعُقيدات الرئوية التي يتم الكشف عنها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب.
تُقيّم العُقيدات الرئوية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة (LDCT)، حيث تُشير خصائص التصوير إلى أسباب حميدة أو خبيثة. قد يؤدي عدم وضوح مآل هذه العُقيدات إلى زيارات متابعة متكررة، وتدخلات غير ضرورية، وعلاج مفرط. قد يُساهم إدراج مُصنِّفات التمثيل الغذائي في الدم ذات القيمة التشخيصية في تحسين تقييم المخاطر والإدارة اللاحقة للعُقيدات الرئوية. التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET).
تشير بيانات دراسة NLST الأمريكية ودراسة NELSON الأوروبية إلى أن فحص المجموعات عالية الخطورة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة (LDCT) قد يقلل من معدل الوفيات الناجمة عن سرطان الرئة1،3. ومع ذلك، لا يزال تقييم المخاطر والإدارة السريرية اللاحقة لأعداد كبيرة من العُقيدات الرئوية العرضية التي يتم اكتشافها بواسطة LDCT يمثل التحدي الأكبر. والهدف الرئيسي هو تحسين التصنيف الصحيح للبروتوكولات الحالية القائمة على LDCT من خلال دمج المؤشرات الحيوية الموثوقة.
تم تحديد بعض المؤشرات الحيوية الجزيئية، مثل مستقلبات الدم، من خلال مقارنة سرطان الرئة مع عينات من أشخاص أصحاء15،17. في هذه الدراسة، ركزنا على تطبيق تحليل الأيض في مصل الدم للتمييز بين العُقيدات الرئوية الحميدة والخبيثة التي تم اكتشافها عرضيًا بواسطة التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة (LDCT). قارنا الأيض الكلي في مصل الدم لعينات من أشخاص أصحاء (HC)، وعُقيدات رئوية حميدة (BN)، وسرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى (LA) باستخدام تحليل UPLC-HRMS. وجدنا أن HC وBN لهما خصائص أيضية متشابهة، بينما أظهر LA تغيرات ملحوظة مقارنةً بـ HC وBN. حددنا مجموعتين من مستقلبات مصل الدم التي تميز LA عن HC وBN.
يعتمد نظام تحديد العُقيدات الحميدة والخبيثة الحالي، القائم على التصوير المقطعي المحوسب منخفض الجرعة، بشكل أساسي على حجم العُقيدات وكثافتها وشكلها ومعدل نموها بمرور الوقت.30 وقد أظهرت دراسات سابقة أن حجم العُقيدات يرتبط ارتباطًا وثيقًا باحتمالية الإصابة بسرطان الرئة. فحتى لدى المرضى المعرضين لخطر كبير، فإن خطر الإصابة بالسرطان في العُقيدات التي يقل حجمها عن 6 مم يقل عن 1%. ويتراوح خطر الإصابة بالسرطان في العُقيدات التي يتراوح حجمها بين 6 و20 مم بين 8% و64%.30 ولذلك، توصي جمعية فليشنر بقطر 6 مم كحد فاصل للمتابعة الروتينية بالتصوير المقطعي المحوسب.29 ومع ذلك، لم يتم تقييم وإدارة مخاطر العُقيدات الرئوية غير المحددة (IPN) التي يزيد حجمها عن 6 مم بشكل كافٍ.31 وتعتمد الإدارة الحالية لأمراض القلب الخلقية عادةً على المراقبة الدقيقة مع المتابعة المتكررة بالتصوير المقطعي المحوسب.
استنادًا إلى الميتابولوم المُدقَّق، أظهرنا لأول مرة تداخل البصمات الأيضية بين الأفراد الأصحاء والعقيدات الحميدة التي يقل حجمها عن 6 مم. يتوافق هذا التشابه البيولوجي مع نتائج التصوير المقطعي المحوسب السابقة التي تُشير إلى أن خطر الإصابة بالأورام الخبيثة في العقيدات التي يقل حجمها عن 6 مم منخفضٌ بنفس مستوى الخطر لدى الأفراد الذين لا يعانون من أي عقيدات.30 تجدر الإشارة إلى أن نتائجنا تُظهر أيضًا تشابهًا كبيرًا في الملامح الأيضية بين العقيدات الحميدة التي يقل حجمها عن 6 مم وتلك التي يبلغ حجمها 6 مم أو أكثر، مما يُشير إلى أن التعريف الوظيفي للأسباب الحميدة ثابتٌ بغض النظر عن حجم العقيدة. وبالتالي، قد تُوفر لوحات الأيض المصلية التشخيصية الحديثة اختبارًا واحدًا كاختبار استبعاد عند اكتشاف العقيدات مبدئيًا في التصوير المقطعي المحوسب، مما قد يُقلل من الحاجة إلى المتابعة المتكررة. في الوقت نفسه، ميّزت نفس لوحة المؤشرات الحيوية الأيضية العقيدات الخبيثة التي يبلغ حجمها 6 مم أو أكثر عن العقيدات الحميدة، وقدمت تنبؤات دقيقة للعقيدات الحليمية داخل الظهارة ذات الحجم المماثل والخصائص المورفولوجية غير الواضحة في صور التصوير المقطعي المحوسب. أظهر هذا المصنف الأيضي في مصل الدم أداءً جيدًا في التنبؤ بخباثة العُقيدات التي يبلغ قطرها 6 مم أو أكثر، حيث بلغت مساحة المنطقة تحت المنحنى (AUC) 0.927. تشير نتائجنا مجتمعةً إلى أن البصمات الأيضية الفريدة في مصل الدم قد تعكس على وجه التحديد التغيرات الأيضية المبكرة التي يُحدثها الورم، ولها قيمة محتملة كمؤشرات تنبؤية للمخاطر، بغض النظر عن حجم العُقيدة.
من الجدير بالذكر أن سرطان الرئة الغدي (LUAD) وسرطان الخلايا الحرشفية (LUSC) هما النوعان الرئيسيان من سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). ونظرًا لارتباط سرطان الخلايا الحرشفية ارتباطًا وثيقًا بتعاطي التبغ47، ولأن سرطان الرئة الغدي هو النمط النسيجي الأكثر شيوعًا في عقيدات الرئة العرضية التي يتم اكتشافها أثناء فحص التصوير المقطعي المحوسب48، فقد تم تصميم نموذج التصنيف الخاص بنا خصيصًا لعينات سرطان الرئة الغدي في المرحلة الأولى. كما ركز وانغ وزملاؤه على سرطان الرئة الغدي، وحددوا تسع بصمات دهنية باستخدام علم الدهون لتمييز سرطان الرئة في مراحله المبكرة عن الأفراد الأصحاء17. اختبرنا نموذج التصنيف الحالي على 16 حالة من سرطان الخلايا الحرشفية في المرحلة الأولى و74 عقيدة حميدة، ولاحظنا دقة تنبؤ منخفضة لسرطان الخلايا الحرشفية (مساحة تحت المنحنى 0.776)، مما يشير إلى أن سرطان الرئة الغدي وسرطان الخلايا الحرشفية قد يكون لكل منهما بصمات أيضية خاصة به. في الواقع، ثبت أن سرطان الرئة الغدي وسرطان الخلايا الحرشفية يختلفان في المسببات والأصل البيولوجي والتشوهات الجينية49. لذلك، ينبغي تضمين أنواع أخرى من علم الأنسجة في نماذج التدريب للكشف عن سرطان الرئة على مستوى السكان في برامج الفحص.
في هذه الدراسة، حددنا المسارات الستة الأكثر تغيراً في سرطان الرئة الغدي مقارنةً بالأفراد الأصحاء والعقيدات الحميدة. يُعد الزانثين والهيبوزانثين من المستقلبات الشائعة في مسار استقلاب البيورين. وتماشياً مع نتائجنا، لوحظ ارتفاع ملحوظ في مستويات المركبات الوسيطة المرتبطة باستقلاب البيورين في مصل أو أنسجة مرضى سرطان الرئة الغدي مقارنةً بالأفراد الأصحاء أو المرضى في المرحلة ما قبل الغازية15،50. قد يعكس ارتفاع مستويات الزانثين والهيبوزانثين في المصل عمليات البناء اللازمة لخلايا السرطان سريعة التكاثر. يُعد اضطراب استقلاب الجلوكوز سمة مميزة معروفة لاستقلاب السرطان51. في هذه الدراسة، لاحظنا زيادة ملحوظة في البيروفات واللاكتات في مجموعة سرطان الرئة الغدي مقارنةً بمجموعتي الأفراد الأصحاء والعقيدات الحميدة، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة عن وجود خلل في مسار تحلل الجلوكوز في ملامح الميتابولوم المصلي لمرضى سرطان الرئة ذي الخلايا غير الصغيرة والأفراد الأصحاء.52،53
لاحظنا، بشكلٍ هام، وجود علاقة عكسية بين استقلاب البيروفات والتريبتوفان في مصل مرضى سرطان الرئة الغدي. انخفضت مستويات التريبتوفان في مصل مجموعة سرطان الرئة الغدي مقارنةً بمجموعتي الأصحاء (HC) والأصحاء (BN). ومن المثير للاهتمام، أن دراسة سابقة واسعة النطاق، باستخدام مجموعة مستقبلية، وجدت أن انخفاض مستويات التريبتوفان في الدورة الدموية يرتبط بزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة54. التريبتوفان حمض أميني أساسي نحصل عليه بالكامل من الطعام. نستنتج أن نقص التريبتوفان في مصل مرضى سرطان الرئة الغدي قد يعكس استنزافًا سريعًا لهذا المستقلب. من المعروف أن الناتج النهائي لهدم التريبتوفان عبر مسار الكينورينين هو مصدر التخليق الحيوي لـ NAD+. ولأن NAD+ يُنتج بشكل أساسي من خلال مسار إعادة التدوير، فإن أهمية NAD+ في استقلاب التريبتوفان في الصحة والمرض لا تزال غير محددة46. أظهر تحليلنا لقاعدة بيانات TCGA أن التعبير عن ناقل التربتوفان، ناقل المذاب 7A5 (SLC7A5)، يزداد بشكل ملحوظ في سرطان الرئة الغدي مقارنةً بالخلايا الطبيعية، ويرتبط ارتباطًا إيجابيًا بالتعبير عن إنزيم تحلل الجلوكوز GAPDH. ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على دور هدم التربتوفان في تثبيط الاستجابة المناعية المضادة للأورام40،41،42. نُبين هنا أن تثبيط امتصاص التربتوفان عن طريق تثبيط SLC7A5 في خلايا سرطان الرئة يؤدي إلى انخفاض لاحق في مستويات NAD الخلوية، وما يصاحب ذلك من تثبيط لنشاط تحلل الجلوكوز. باختصار، تُقدم دراستنا أساسًا بيولوجيًا للتغيرات في استقلاب المصل المرتبطة بالتحول الخبيث لسرطان الرئة الغدي.
تُعدّ طفرات مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) أكثر الطفرات المُسببة شيوعًا لسرطان الرئة ذي الخلايا غير الصغيرة (NSCLC). في دراستنا، وجدنا أن المرضى الذين يحملون طفرة EGFR (ن = 41) لديهم أنماط أيضية عامة مشابهة للمرضى الذين يحملون النمط البري من EGFR (ن = 31)، على الرغم من أننا وجدنا انخفاضًا في مستويات الأسيل كارنيتين في مصل بعض المرضى الذين يحملون طفرة EGFR. تتمثل الوظيفة المعروفة للأسيل كارنيتين في نقل مجموعات الأسيل من السيتوبلازم إلى مصفوفة الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى أكسدة الأحماض الدهنية لإنتاج الطاقة.55 وتماشيًا مع نتائجنا، حددت دراسة حديثة أيضًا أنماطًا أيضية متشابهة بين أورام EGFR الحاملة للطفرة وأورام EGFR ذات النمط البري من خلال تحليل الأيض الكلي لـ 102 عينة من أنسجة سرطان غدي رئوي.50 ومن المثير للاهتمام، أنه تم العثور على محتوى الأسيل كارنيتين أيضًا في مجموعة EGFR الحاملة للطفرة. لذلك، فإن ما إذا كانت التغيرات في مستويات الأسيل كارنيتين تعكس تغيرات أيضية ناتجة عن EGFR والمسارات الجزيئية الكامنة وراءها قد تستحق مزيدًا من الدراسة.
في الختام، تُؤسس دراستنا مُصنفًا استقلابيًا في مصل الدم للتشخيص التفريقي للعقيدات الرئوية، وتقترح سير عمل يمكنه تحسين تقييم المخاطر وتسهيل الإدارة السريرية بناءً على فحص التصوير المقطعي المحوسب.
حصلت هذه الدراسة على موافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة صن يات صن للسرطان، والمستشفى الأول التابع لجامعة صن يات صن، ولجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة تشنغتشو للسرطان. في مجموعتي الاكتشاف والتحقق الداخلي، جُمعت 174 عينة مصل من أفراد أصحاء و244 عينة مصل من عُقيدات حميدة من أفراد يخضعون لفحوصات طبية سنوية في قسم مكافحة السرطان والوقاية منه، مركز صن يات صن للسرطان، بالإضافة إلى 166 عينة مصل من عُقيدات حميدة. جُمعت عينات من سرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى من مركز صن يات صن للسرطان. أما في مجموعة التحقق الخارجي، فقد شملت 48 حالة عُقيدات حميدة، و39 حالة سرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى من المستشفى الأول التابع لجامعة صن يات صن، و24 حالة سرطان غدي رئوي من المرحلة الأولى من مستشفى تشنغتشو للسرطان. جمع مركز صن يات صن الجامعي للسرطان أيضًا 16 حالة من سرطان الرئة ذي الخلايا الحرشفية في المرحلة الأولى لاختبار القدرة التشخيصية للمصنف الأيضي المُعتمد (تُعرض خصائص المرضى في الجدول التكميلي 5). جُمعت عينات من مجموعة الاكتشاف ومجموعة التحقق الداخلي بين يناير 2018 ومايو 2020. وجُمعت عينات مجموعة التحقق الخارجي بين أغسطس 2021 وأكتوبر 2022. ولتقليل التحيز الجنسي، خُصصت أعداد متساوية تقريبًا من حالات الذكور والإناث لكل مجموعة. فريق الاكتشاف وفريق المراجعة الداخلية. حُدد جنس المشاركين بناءً على إفادتهم الذاتية. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين ولم تُقدم أي تعويضات. كان الأشخاص المصابون بعقيدات حميدة هم أولئك الذين لديهم نتيجة مستقرة في فحص التصوير المقطعي المحوسب لمدة تتراوح بين سنتين وخمس سنوات وقت التحليل، باستثناء حالة واحدة من عينة التحقق الخارجي، والتي جُمعت قبل الجراحة وشُخصت عن طريق الفحص النسيجي. باستثناء التهاب الشعب الهوائية المزمن. جُمعت حالات سرطان غدي رئوي قبل استئصال الرئة، وتأكدت التشخيصات النسيجية. جُمعت عينات دم صائم في أنابيب فصل المصل دون استخدام أي مضادات تخثر. خُضعت عينات الدم للتخثر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم طُردت مركزياً بسرعة 2851 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل المصل. جُمدت أجزاء من المصل عند -80 درجة مئوية لحين استخلاص المستقلبات. جمع قسم الوقاية من السرطان والفحص الطبي في مركز صن يات صن الجامعي للسرطان عينة مصل مجمعة من 100 متبرع سليم، من بينهم عدد متساوٍ من الرجال والنساء الذين تتراوح أعمارهم بين 40 و55 عاماً. خُلطت أحجام متساوية من كل عينة متبرع، وقُسمت العينة المجمعة الناتجة إلى أجزاء صغيرة وخُزنت عند -80 درجة مئوية. استُخدم مزيج المصل كمادة مرجعية لمراقبة الجودة وتوحيد البيانات.
تم إذابة عينات المصل المرجعية وعينات الاختبار، واستُخلصت المستقلبات باستخدام طريقة استخلاص مُدمجة (ميثيل ثالثي بوتيل الإيثر/ميثانول/ماء) 56. باختصار، مُزج 50 ميكرولتر من المصل مع 225 ميكرولتر من الميثانول المُثلج و750 ميكرولتر من ميثيل ثالثي بوتيل الإيثر (MTBE) المُثلج. حُرّك المزيج وحُضن على الجليد لمدة ساعة. بعد ذلك، مُزجت العينات مع 188 ميكرولتر من الماء النقي المُستخدم في التحليل الطيفي الكتلي، والذي يحتوي على معايير داخلية (13C-لاكتات، 13C3-بيروفات، 13C-ميثيونين، و13C6-إيزولوسين، تم شراؤها من مختبرات كامبريدج للنظائر). ثم خُضعت العينة للطرد المركزي عند قوة 15000 × g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ونُقلت الطبقة السفلية إلى أنبوبين (125 ميكرولتر لكل منهما) لتحليلها بتقنية LC-MS في الوضعين الموجب والسالب. وأخيرًا، جُففت العينة بالتبخير في جهاز تركيز فراغي عالي السرعة.
أُعيد إذابة المستقلبات المجففة في 120 ميكرولتر من الأسيتونيتريل بتركيز 80%، وخُلطت باستخدام جهاز الخلط الدوامي لمدة 5 دقائق، ثم فُصلت بالطرد المركزي عند 15000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نُقلت الرواسب إلى قوارير زجاجية كهرمانية مزودة بأنابيب دقيقة لإجراء دراسات الأيض. أُجري تحليل الأيض غير الموجه باستخدام منصة كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بقياس الطيف الكتلي عالي الدقة (UPLC-HRMS). فُصلت المستقلبات باستخدام نظام Dionex Ultimate 3000 UPLC وعمود ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 مم، 1.7 ميكرومتر، Waters). في وضع الأيونات الموجبة، كانت الأطوار المتحركة عبارة عن 95% (أ) و50% أسيتونيتريل (ب)، يحتوي كل منهما على 10 ملي مول/لتر من أسيتات الأمونيوم و0.1% حمض الفورميك. في الوضع السالب، احتوى الطوران المتحركان A وB على 95% و50% من الأسيتونيتريل على التوالي، واحتوى كلا الطورين على 10 ملي مول/لتر من أسيتات الأمونيوم، عند درجة حموضة 9. وكان برنامج التدرج كما يلي: من 0 إلى 0.5 دقيقة، 2% B؛ من 0.5 إلى 12 دقيقة، من 2% إلى 50% B؛ من 12 إلى 14 دقيقة، من 50% إلى 98% B؛ من 14 إلى 16 دقيقة، 98% B؛ من 16 إلى 16.1 دقيقة، من 98% إلى 2% B؛ من 16.1 إلى 20 دقيقة، 2% B. حُفظ العمود عند درجة حرارة 40 درجة مئوية، والعينة عند درجة حرارة 10 درجات مئوية في جهاز أخذ العينات التلقائي. وكان معدل التدفق 0.3 مل/دقيقة، وحجم الحقن 3 ميكرولتر. تم تشغيل مطياف الكتلة Q-Exactive Orbitrap (من شركة Thermo Fisher Scientific) المزود بمصدر تأين بالرذاذ الإلكتروني (ESI) في وضع المسح الكامل، وتم ربطه بوضع مراقبة ddMS2 لجمع كميات كبيرة من البيانات. تم ضبط معايير مطياف الكتلة على النحو التالي: جهد الرش +3.8 كيلو فولت / -3.2 كيلو فولت، درجة حرارة الشعيرة 320 درجة مئوية، غاز الحماية 40 وحدة تعسفية، الغاز المساعد 10 وحدات تعسفية، درجة حرارة سخان المجس 350 درجة مئوية، نطاق المسح 70-1050 م/ساعة، الدقة 70000. تم الحصول على البيانات باستخدام برنامج Xcalibur 4.1 (من شركة Thermo Fisher Scientific).
لتقييم جودة البيانات، تم تحضير عينات مراقبة الجودة المجمعة عن طريق سحب 10 ميكرولتر من الراشح من كل عينة. تم تحليل ست حقن من عينات مراقبة الجودة في بداية التسلسل التحليلي لتقييم استقرار نظام UPLC-MS. ثم تُضاف عينات مراقبة الجودة دوريًا إلى الدفعة. تم تحليل جميع دفعات عينات المصل الإحدى عشرة في هذه الدراسة باستخدام LC-MS. استُخدمت أجزاء من مزيج مصل مجمع من 100 متبرع سليم كمادة مرجعية في كل دفعة لمراقبة عملية الاستخلاص وتعديل تأثيرات الدفعات المختلفة. أُجري تحليل الميتابولوميات غير الموجه لمجموعة الاكتشاف، ومجموعة التحقق الداخلي، ومجموعة التحقق الخارجي في مركز الميتابولوميات بجامعة صن يات صن. كما قام المختبر الخارجي لمركز التحليل والاختبار بجامعة قوانغدونغ للتكنولوجيا بتحليل 40 عينة من المجموعة الخارجية لاختبار أداء نموذج التصنيف.
بعد الاستخلاص وإعادة التكوين، تم قياس الكمية المطلقة لمستقلبات المصل باستخدام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بمطياف الكتلة الترادفي (Agilent 6495 ثلاثي الأقطاب) مع مصدر تأين بالرذاذ الإلكتروني (ESI) في وضع مراقبة التفاعل المتعدد (MRM). استُخدم عمود ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 مم، 1.7 ميكرومتر، Waters) لفصل المستقلبات. يتكون الطور المتحرك من 90% (أ) و5% أسيتونيتريل (ب) مع 10 ملي مول/لتر من أسيتات الأمونيوم و0.1% محلول أمونيا. كان برنامج التدرج كما يلي: 0-1.5 دقيقة، 0% ب؛ 1.5-6.5 دقيقة، 0-15% ب؛ 6.5-8 دقائق، 15% ب؛ 8-8.5 دقائق، 15%-0% ب. من 8.5 إلى 11.5 دقيقة، 0% B. حُفظ العمود عند درجة حرارة 40 درجة مئوية، والعينة عند درجة حرارة 10 درجات مئوية في جهاز أخذ العينات التلقائي. كان معدل التدفق 0.3 مل/دقيقة، وحجم الحقن 1 ميكرولتر. ضُبطت معايير مطياف الكتلة كما يلي: جهد الشعيرة ±3.5 كيلو فولت، وضغط البخاخ 35 رطل/بوصة مربعة، وتدفق غاز الغلاف 12 لتر/دقيقة، ودرجة حرارة غاز الغلاف 350 درجة مئوية، ودرجة حرارة غاز التجفيف 250 درجة مئوية، وتدفق غاز التجفيف 14 لتر/دقيقة. كانت تحويلات MRM للتريبتوفان، والبيروفات، واللاكتات، والهيبوكسانثين، والزانثين على التوالي: 205.0-187.9، و87.0-43.4، و89.0-43.3، و135.0-92.3، و151.0-107.9. جُمعت البيانات باستخدام برنامج Mass Hunter B.07.00 (شركة Agilent Technologies). بالنسبة لعينات المصل، تم قياس كمية التربتوفان، والبيروفات، واللاكتات، والهيبوكسانثين، والزانثين باستخدام منحنيات معايرة لمحاليل قياسية. أما بالنسبة لعينات الخلايا، فقد تم توحيد محتوى التربتوفان وفقًا للمعيار الداخلي وكتلة بروتين الخلية.
تم استخلاص القمم (نسبة الكتلة إلى الشحنة وزمن الاحتفاظ) باستخدام برنامجي Compound Discovery 3.1 وTraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). ولإزالة أي اختلافات محتملة بين الدفعات، قُسِّمت كل قمة مميزة لعينة الاختبار على القمة المميزة للمادة المرجعية من نفس الدفعة للحصول على الوفرة النسبية. يوضح الجدول التكميلي 6 الانحرافات المعيارية النسبية للمعايير الداخلية قبل وبعد المعايرة. تميزت الاختلافات بين المجموعتين بمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR<0.05، اختبار ويلكوكسون للإشارات المرتبة) ونسبة التغير (>1.2 أو <0.83). تُعرض بيانات مطياف الكتلة الخام للخصائص المستخلصة وبيانات مطياف الكتلة المصححة باستخدام مصل مرجعي في البيانات التكميلية 1 والبيانات التكميلية 2 على التوالي. تم تحديد القمم بناءً على أربعة مستويات تعريف محددة، تشمل المستقلبات المُعرَّفة، والمركبات المُحتملة التعريف، وفئات المركبات المُحتملة التوصيف، والمركبات غير المعروفة. استنادًا إلى عمليات البحث في قواعد البيانات في برنامج Compound Discovery 3.1 (mzCloud، HMDB، Chemspider)، تم اختيار المركبات البيولوجية التي تتطابق بياناتها في مطياف الكتلة الترادفي (MS/MS) مع المعايير المعتمدة أو التي تتطابق بياناتها تمامًا في mzCloud (بدرجة > 85) أو Chemspider، كمركبات وسيطة بين الميتابولوم التفاضلي. تُدرج بيانات الذروة لكل خاصية في البيانات التكميلية 3. استُخدم برنامج MetaboAnalyst 5.0 لتحليل وفرة المستقلبات بعد توحيد مجموعها. كما قيّم MetaboAnalyst 5.0 تحليل إثراء مسارات KEGG بناءً على المستقلبات المختلفة بشكلٍ ملحوظ. تم تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA) باستخدام حزمة برامج ropls (الإصدار 1.26.4) مع توحيد التراكم والتحجيم التلقائي. تم توليد نموذج المؤشر الحيوي الأيضي الأمثل للتنبؤ بخباثة العُقيدات باستخدام الانحدار اللوجستي الثنائي مع عامل الانكماش والاختيار المطلق الأدنى (LASSO، حزمة R الإصدار 4.1-3). وتم تقييم أداء النموذج التمييزي في مجموعتي الكشف والتحقق من خلال تقدير مساحة المنطقة تحت المنحنى (AUC) بناءً على تحليل منحنى ROC وفقًا لحزمة pROC (الإصدار 1.18.0). وتم الحصول على قيمة القطع الاحتمالية المثلى بناءً على أعلى مؤشر يودن للنموذج (الحساسية + النوعية - 1). وسيتم تصنيف العينات ذات القيم الأقل من العتبة على أنها عُقيدات حميدة، بينما سيتم تصنيف العينات ذات القيم الأكبر منها على أنها سرطان غدي رئوي.
زُرعت خلايا A549 (رقم CCL-185، المجموعة الأمريكية لزراعة الأنسجة) في وسط F-12K يحتوي على 10% من مصل بقري جنيني (FBS). أُدخلت تسلسلات الحمض النووي الريبوزي القصير ذي الحلقة الدبوسية (shRNA) المُستهدفة لجين SLC7A5، بالإضافة إلى تسلسل تحكم غير مُستهدف (NC)، في ناقل الفيروس البطيء pLKO.1-puro. التسلسلات المضادة لـ shSLC7A5 هي كالتالي: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′)، Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). تم شراء الأجسام المضادة لـ SLC7A5 (رقم 5347) والتوبولين (رقم 2148) من شركة Cell Signaling Technology. استُخدمت الأجسام المضادة لـ SLC7A5 والتوبولين بتخفيف 1:1000 في تحليل لطخة ويسترن.
يقيس اختبار الإجهاد الجليكولي Seahorse XF مستويات تحمض الوسط خارج الخلوي (ECAR). في هذا الاختبار، تم إعطاء الجلوكوز، والأوليغوميسين أ، و2-ديوكسي جلوكوز بالتتابع لاختبار قدرة الخلايا على تحلل الجلوكوز كما تم قياسها بواسطة ECAR.
زُرعت خلايا A549 المُعدّلة وراثيًا باستخدام جين التحكم غير المُستهدف (NC) وجين shSLC7A5 (Sh1، Sh2) طوال الليل في أطباق قطرها 10 سم. استُخلصت نواتج أيض الخلايا باستخدام 1 مل من محلول ميثانول مائي بارد بنسبة 80%. كُشطت الخلايا الموجودة في محلول الميثانول، وجُمعت في أنبوب جديد، ثم خُضعت للطرد المركزي بسرعة 15000 × g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. جُمع 800 ميكرولتر من الراشح وجُفف باستخدام مُركِّز فراغي عالي السرعة. ثم حُللت رواسب نواتج الأيض المُجففة لتحديد مستويات التربتوفان باستخدام تقنية LC-MS/MS كما هو موضح سابقًا. قُيست مستويات NAD(H) الخلوية في خلايا A549 (NC وshSLC7A5) باستخدام مجموعة قياس لونية كمية لـ NAD+/NADH (#K337، BioVision) وفقًا لتعليمات الشركة المُصنِّعة. تم قياس مستويات البروتين لكل عينة لتطبيع كمية المستقلبات.
لم تُستخدم أي أساليب إحصائية لتحديد حجم العينة مبدئيًا. وقد اعتُبرت دراسات الأيض السابقة التي هدفت إلى اكتشاف المؤشرات الحيوية15،18 معايير مرجعية لتحديد حجم العينة، وبالمقارنة مع هذه التقارير، كانت عيّنتنا كافية. لم تُستبعد أي عينات من مجموعة الدراسة. تم توزيع عينات المصل عشوائيًا على مجموعتين: مجموعة الاكتشاف (306 حالات، 74.6%) ومجموعة التحقق الداخلي (104 حالات، 25.4%) لدراسات الأيض غير الموجهة. كما اخترنا عشوائيًا 70 حالة من كل مجموعة من مجموعة الاكتشاف لدراسات الأيض الموجهة. لم يكن الباحثون على علم بتوزيع المجموعات أثناء جمع بيانات LC-MS وتحليلها. وُصفت التحليلات الإحصائية لبيانات الأيض وتجارب الخلايا في أقسام النتائج، وشروح الأشكال، والأساليب ذات الصلة. أُجري قياس كمية التربتوفان الخلوي، وNADT، ونشاط تحلل الجلوكوز ثلاث مرات بشكل مستقل، وكانت النتائج متطابقة.
للحصول على مزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص تقرير المحفظة الطبيعية المرتبط بهذه المقالة.
تُعرض بيانات قياس الطيف الكتلي الخام للخصائص المستخرجة وبيانات قياس الطيف الكتلي المُعَيَّرة لمصل الدم المرجعي في البيانات التكميلية 1 والبيانات التكميلية 2 على التوالي. وتُعرض شروح القمم للخصائص التفاضلية في البيانات التكميلية 3. ويمكن تنزيل مجموعة بيانات LUAD TCGA من https://portal.gdc.cancer.gov/. وتُقدم بيانات الإدخال لرسم المخطط البياني في بيانات المصدر. كما تُقدم بيانات المصدر لهذه المقالة.
مجموعة دراسة الفحص الوطني للرئة، إلخ. خفض معدل الوفيات الناجمة عن سرطان الرئة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة. شمال إنجلترا. مجلة الطب 365، 395-409 (2011).
كريمر، بي إس، بيرغ، كيه دي، أبيرلي، دي آر، وبروفيت، بي سي. فحص سرطان الرئة باستخدام التصوير المقطعي الحلزوني منخفض الجرعة: نتائج من الدراسة الوطنية لفحص الرئة (NLST). مجلة الفحص الطبي 18، 109-111 (2011).
دي كونينغ، إتش جيه، وآخرون. خفض معدل الوفيات الناجمة عن سرطان الرئة باستخدام فحص التصوير المقطعي المحوسب الحجمي في تجربة عشوائية. مجلة شمال إنجلترا الطبية 382، 503-513 (2020).
تاريخ النشر: 18 سبتمبر 2023